3. KẾT QUẢ TẠO THƢ VIỆN scFv VÀ CHỌN DÒNG scFv ĐẶC HIỆU HER
3.2. Kết quả tạo kháng thể phage đặc hiệu HER
Để sử dụng kháng thể trong tạo KIT chẩn đoán kháng nguyên HER2 trong các mẫu huyết thanh, chúng tôi đã sử dụng kháng thể scFv biểu lộ trên phage. Kháng thể biểu lộ trên phage là một trong các dạng liên kết đặc biệt giữa kiểu hình (kháng thể scFv biểu lộ trên bề mặt phage) và kiểu gen (gen mã hóa scFv được gắn vào hệ gen của phage). Vì vậy, phức hệ này vừa có thể sử dụng phần kiểu hình scFv để gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên HER2 trong huyết thanh và phần kiểu gen là gen mã hóa scFv được gắn trong hệ gen phage trong kỹ thuật real-time PCR (PCR định lượng).
Tạo phage biểu hiện scFv trên bề mặt
Vi khuẩn E. coli chủng TG1 chứa phagemid pHEN2 (dòng số 7) đã được gắn gen mã hóa các vùng biến đổi của kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2 được ủ trong môi trường 2xTY chứa 2% glucose và 100 μg/ml Amp, và sau đó nuôi lắc (250
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
v/p) ở 37 oC cho tới khi đạt OD600 = 0.5 thì bổ sung helper phage M13K07 (109 p.f.u./ml, Amersham Pharmacia Biotech). Dịch nuôi được lắc nhẹ thêm 1 giờ ở 37 oC. Ly tâm 4.000 v/p, thời gian 5 phút để thu tế bào, hoà tế bào vào môi trường 2xTY chứa 100 g/ml Amp và 50 g/ml Ka. Nuôi lắc qua đêm ở 30 oC để thu phage. Sau đó chuẩn phage để xác định CFU và xác định hình thái cấu trúc của phage biểu lộ scFv của kháng thể dưới kính hiển vi điện tử (hình 32).
Sự biểu hiện các scFv trên bề mặt kháng thể còn được kiểm tra trong chủng biểu hiện không ức chế, E. coli HB2151 (hình 33).
Trên hình 33, ta thấy ở các giếng 2, 4, 6, 7, 8 là các giếng sau khi cảm ứng bởi IPTG xuất hiện các băng protein đậm và khác biệt so với mẫu ở các giếng 3, 5 là các mẫu đối chứng không bổ sung IPTG. Kết quả này một lần nữa khẳng định kết quả lắp ghép gen mã hóa scFv của kháng thể đặc hiệu HER2 trong phagemid pHEN2 cũng như khả năng biểu lộ scFv đặc hiệu kháng nguyên HER2 trên bề mặt phage. Mô hình biểu lộ scFv của kháng thể trên bề mặt phage được thể hiện ở hình 34.
Một trong các ưu điểm của phương thức biểu lộ này là phân tử scFv được biểu hiện ở trạng thái cấu trúc thật, và vì vậy có thể sử dụng được ngay cho các phân tích
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 33. Kiểm tra sự biểu hiện của scFv trong chủng không ức chế E. coli HB2151