Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 KẾT QUẢ TẠO KHÁNG NGUYÊN HER2 TÁI TỔ HỢP
1.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HER
Vector pET-22b(+) được chọn làm hệ vector biểu hiện gen mã hóa vùng ngoại bào của HER2. Cả vector pET-22b(+) và pTZ57R/T-HER2 đều được cắt bởi NdeI và
XhoI để tạo các đầu dính sole tương thích. Qui trình tạo vector tái tổ hợp có chứa đoạn gen HER2 được tiến hành theo 4 bước sau:
(1) Nhân dòng vector pET-22b(+) trong tế bào E. coli TOP10.
(2) Cắt plasmid pET-22b(+) và pTZ57R/T-HER2 bằng enzyme NdeI và XhoI. Kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose 0.8%. Sau đó đoạn gen HER2 và đoạn vector pET-22b(+) mở vòng được tinh sạch bằng kit thôi gel của hãng Qiagen.
(3) Ghép nối đoạn gen HER2 vào vector pET-22b(+) mở vòng nhờ sự hỗ trợ của enzyme ghép nối T4-DNA ligase. Tiếp đó vector tái tổ hợp được biến nạp vào chủng tế bào trung gian E. coli TOP10 để nhân lượng lớn.
Hình 19. Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid bằng enzyme NdeI và XhoI
M: Marker DNA 1Kb (Fermentas)
2-4:Sản phẩm cắt plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(4) Kiểm tra kết quả tạo vector biểu hiện gen HER2 bằng các enzyme giới hạn và xác định trình tự để khẳng định chiều, khung đọc theo thiết kế. Biến nạp vector biểu hiện vào chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli BL21 DE3(star).
Đoạn gen HER2 từ vector tái tổ hợp pTZ57R/T và pET-22b(+) được cắt đồng thời bởi NdeI và XhoI. Hỗn hợp phản ứng cắt (các thành phần được nêu ở bảng 10) được ủ ở 37 o
C trong thời gian 4 giờ. Kết quả được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%, đoạn gen và vector mở vòng được thu hồi bằng phương pháp thôi gel theo kit của QIAGEN (hình 20). Bảng 10. Thành phần phản ứng cắt pET-22b(+) và pTZ57R/T-HER2 Thành phần Thể tích (µl) H2O 7.5 NdeI 0.5 XhoI 0.5 Buffer II 1.5 Plasmid 5.0 Tổng thể tích 15
Trên điện di đồ cho thấy đoạn gen HER2 (~1900 bp) và vector pET-22b(+) mở vòng (~5500 bp) đã được thu hồi đạt nồng độ và độ tinh sạch cần thiết cho phản ứng ghép nối để tạo vector tái tổ hợp pET-22b(+)-HER2. Thành phần phản ứng ghép nối được trình bày ở bảng 11.
Hình 20. Điện di sản phẩm cắt và tinh sạch gen HER2, vector pET-22b(+) M: Marker DNA 1kb (Fermentas)
1-2: Sản phẩm cắt pTZ57R/T-HER2 và pET-22b(+) bằng XhoI và NdeI 3-4: Sản phẩm tinh sạch đoạn gen HER2 và pET-22b(+) mở vòng
Bảng 11. Thành phần phản ứng ghép nối gen (ligation) Thành phần Thể tích (µl) H2O 3.9 T4 DNA ligase 0.6 Buffer 1.0 HER2 3.0 pET-22b(+) mở vòng 1.5 Tổng thể tích 10
Phản ứng ghép nối gen được tiến hành ở 16 oC trong 18 giờ. Sau đó hỗn hợp phản ứng được giữ ở 4 oC và được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42 0O
C trong 60 giây. Tế bào được cấy trải trên môi trường LB có Amp và nuôi ở 37 oC trong 24 giờ.
Chọn 3 dòng khuẩn lạc, tiến hành hoạt hóa qua đêm trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp 100 g/ml ở 37 oC trong điều kiện lắc 200v/ph. Tách plasmid bằng kit của Bioneer và cắt kiểm tra plasmid thu được bằng hai enzyme giới hạn XhoI và NdeI. Kết quả được thể hiện bằng điện di trên gel agarose 0.8% (hình 21).
Trên điện di đồ cho thấy sản phẩm cắt (giếng 1-3) bằng 2 enzyme giới hạn XhoI và NdeI đã thu được hai băng có kích thước tương ứng với kích thước của đoạn gen
HER2 (~1900 bp) và pET-22b(+) (~5500 bp). Như vậy, có thể khẳng định vector tái tổ hợp đã được biến nạp thành công vào tế bào E. coli TOP10.
Hình 21. Điện di đồ sản phẩm tách plasmid và cắt kiểm tra việc biến nạp đoạn gen HER2 vào vector biểu hiện pET-22b(+)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
M: Marker DNA 1kb (Fermentas)
1-3: Sản phẩm cắt bằng XhoI và NdeI của 3 dòng plasmid 4-6 4-6: 3 dòng plasmid được chọn ngẫu nhiên sau khi biến nạp
Để khẳng định đoạn gen HER2 đã được đưa vào vector biểu hiện pET-22b(+) đúng khung đọc, không xuất hiện lỗi trong khi sao chép của DNA, chúng tôi đã tinh sạch và xác định trình tự nucleotide đoạn gen của vector biểu hiện pET-22b(+) chứa đoạn gen HER2. Trình tự nhận được, sau khi xử lý bằng phần mềm Bioedit và Gendoc thể hiện đúng với những tính toán lý thuyết. Như vậy, vector tái tổ hợp pET-22b(+)- HER2 hoàn toàn có đủ khả năng để biểu hiện trong tế bào E. coli.