Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 KẾT QUẢ TẠO KHÁNG NGUYÊN HER2 TÁI TỔ HỢP
1.4.Kết quả biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HER
Khi so sánh trình tự amino acid của đoạn protein HER2 đã tách dòng với các trình tự amino acid trên ngân hàng gen (phụ lục 1) cho thấy đoạn protein nghiên cứu có trình tự tương đồng cao với các đoạn trình tự HER2 được phân lập từ người ở Nhật Bản (BAG59464, BAG58195), ở Mỹ (AAX40997, AA75493.1) và Thổ Nhĩ Kỳ (NM 004448)... Điều đó chứng tỏ ở cấp độ protein HER2 cũng có độ bảo thủ cao giữa các mẫu ở các vùng khác nhau trên thế giới.
Chủng E. coli BL21 DE3(star) được lựa chọn là vật chủ dùng để biểu hiện vector tái tổ hợp có mang gen HER2. Đây là chủng được hãng Invitrogen thiết kế với nhiều ưu điểm trong cấu trúc di truyền giúp tăng mức độ biểu hiện của các protein không độc
Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp có mang đoạn gen HER2 vào tế bào E. coli
BL21 DE3(star) bằng phương pháp sốc nhiệt. Cấy trải sản phẩm biến nạp trên môi trường LB có chọn lọc Amp 100 µg/ml.
Chọn một khuẩn lạc riêng rẽ hoạt hoá qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (100 µg/ml) ở 37 oC điều kiện lắc 200 v/ph. Sau đó dịch nuôi cấy được chuyển sang môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (100 µg/ml) và nuôi lắc tiếp cho đến khi OD600 đạt 0.8 (khoảng 3h). Một phần dịch nuôi được thu để làm mẫu trước cảm ứng, lượng dịch nuôi còn lại sẽ được cảm ứng với IPTG (nồng độ cuối cùng của IPTG là 0.5 mM). Mẫu cảm ứng được thu lại sau khi cảm ứng 4 h và kết quả biểu hiện gen HER2 được thể hiện trên hình 22.
Hình 22. Kết quả biểu hiện gen HER2 trong E. coli BL21 DE3(star) M: Marker protein (Fermentas)
1: Protein tổng số trước cảm ứng
2: Protein tổng số sau khi cảm ứng với 0.5 mM IPTG
Kết quả điện di trên gel polyacrylamide cho thấy, ở mẫu sau cảm ứng có xuất hiện 1 băng protein có kích thước khoảng 67 kDa và khác biệt so với mẫu trước cảm ứng. Từ kết quả đó có thể thấy rằng đoạn protein mã hóa cho phần ngoại bào của thụ thể phát triển biểu mô HER2 đã được biểu hiện thành công trong tế bào E. coli BL21 DE3(star). Do protein tái tổ hợp có đuôi ái lực 6-Histidin, nên các protein tái tổ hợp có khả năng liên kết với ion Ni2+ trên cột sắc ký ái lực ion. Dịch tế bào biểu hiện được nuôi với lượng 50 ml, cảm ứng bằng IPTG với nồng độ cuối cùng 0.5 mM trong thời gian 4 h. Sau khi ly tâm, cặn tế bào được hòa lại trong 8 ml dịch phá (Lysis Buffer) và được siêu âm trong thời gian 5 phút. Dịch phá tế bào được ly tâm, phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột. Các protein có đuôi 6-Histidin có ái lực với Ni2+ và được bám chặt lên chất giá trên cột. Sau khi rửa cột bằng đệm rửa (Wash Buffer) các protein của E. coli không có hoặc có ít gốc histidine liên tục nhau sẽ bị trôi khỏi cột chỉ còn lại các protein có ái lực cao với Ni2+ được giữ lại. Sau đó protein gắn trên cột sẽ được loại ra khỏi cột nhờ Elution Buffer, chúng tôi thu 3 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml.
Sau khi tinh chế protein được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,5% (hình 23). Kết quả trên điện di đồ thu được 1 băng protein đặc hiệu có kích thước ~67 kDa, chứng tỏ protein tái tổ hợp HER2 đã được tinh sạch thành công.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau khi tinh sạch mẫu protein được xác định nồng độ bằng máy NanoDrop- 1000 (hình 24). Kết quả nhận được lượng kháng nguyên tinh sạch ở phân đoạn 1 là 0.3 mg/ml, ở phân đoạn 2 là 3 mg/ml, và phân đoạn 3 là 7 mg/ml.