2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Các phƣơng pháp thao tác với DNA
2.1.2. RT-PCR nhân bản gen mã hóa kháng nguyên, kháng thể
Phản ứng RT-PCR dựa trên nguyên tắc của chuỗi phản ứng trùng hợp PCR, trong đó có sử dụng enzyme phiên mã ngược có khả năng sử dụng RNA làm khuôn tổng hợp DNA. Phản ứng RT-PCR gồm hai giai đoạn chính là giai đoạn tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ tác dụng của enzyme phiên mã ngược và giai đoạn tổng hợp DNA dưới tác dụng của DNA-polymerase.
Quá trình nhân đoạn gen mã hóa các kháng nguyên từ bệnh phẩm, gen mã hóa vùng hằng định của kháng thể người hoặc gen mã hóa các kháng thể gà từ tủy xương gà đã gây miễn dịch với các kháng nguyên đặc hiệu HER2 sau khi đã tách RNA tổng số được tiến hành theo quy trình sử dụng kit “one-step RT-PCR” của hãng Invitrogen với cặp mồi đặc hiệu cho gen cần tách dòng. Thành phần phản ứng nhân bản gen từ RNA tổng số được trình bày ở bảng 3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3. Thành phần phản ứng RT-PCR
Thành phần Nồng độ Thể tích (l)
Hỗn hợp phản ứng (đệm phản ứng) 2X 25 RNA đặc hiệu đối với gen HER2 200 pg 15 Mồi xuôi đặc hiệu gen HER2 10 pM 1.5 Mồi ngược đặc hiệu gen HER2 10 pM 1.5
RT/Platinum Taq 2 Unit 1
H2O đủ 50
Sau khi đã trộn đều các thành phần, phản ứng RT-PCR được tiến hành trên máy PCR với chu trình nhiệt như sau:
Bước 1: 50 C thời gian 30 phút Bước 2: 94 C thời gian 2 phút Bước 3: 94 C thời gian 15 giây Bước 4: 57 C thời gian 30 giây Bước 5: 72 C thời gian 1 phút 30 giây Bước 6: Lặp lại 30 chu kì từ bước 3 đến bước 5 Bước 7: 72 C thời gian 8 phút Bước 8: bảo quản ở 4 C
Sản phẩm RT-PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%.