Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector pTZ57R/T

2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Các phƣơng pháp thao tác với DNA

2.1.3. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector pTZ57R/T

Các sản phẩm của phản ứng PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pTZ57R/T. Điều này có thể thực hiện được khá dễ dàng là do khả năng tổng hợp thêm một Adenine ở đầu 3’ của sản phẩm PCR dưới tác dụng của enzyme Taq DNA polymerase mà không phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn. Trong khi đó vector tách dòng pTZ57R/T được thiết kế có chứa một nucleotide T ở đầu 3’. Do vậy, khi có mặt enzyme topoisomerase, sản phẩm của phản ứng RT-PCR có thể được gắn chính xác vào vector tách dòng. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector pTZ57R/T được trình bày ở bảng 4.

Bảng 4. Thành phần phản ứng gắn

Thành phần Thể tích

Sản phẩm PCR 4 l

T4 ligase 1 l

Vector pTZ57R/T 1 l Nước tinh khiết 4 l

Hỗn hợp phản ứng gắn được ủ ở nhiệt độ 22 oC, thời gian 30 phút sau đó được giữ tại 4 oC trong thời gian chuẩn bị để biến nạp vào tế bào khả biến.

2.1.4. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli

Nguyên tắc

Dựa vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen kháng kháng sinh có trong đoạn DNA ngoại lai.

Cách tiến hành

Chuẩn bị tế bào khả biến

- Lấy chủng tế bào được cất giữ ở -75 oC

- Cấy vạch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc, ủ đĩa cấy qua đêm ở 37 oC. Nhặt một khuẩn lạc nuôi cấy trong 2ml môi trường LB lỏng.

- Cấy chuyển 2% dịch nuôi tế bào qua đêm sang 2ml môi trường LB lỏng. Nuôi lắc ở 37 oC, 200v/p trong 90 phút đến khi OD600 đạt 0.5-0.7.

- Chuyển dịch tế bào sang ống Eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút - Ly tâm thu sinh khối (5000v/p, 4 oC trong 10 phút).

- Loại dịch nổi, đặt ống chứa tế bào trong đá 10 phút. - Hòa tan cặn tế bào trong 1ml CaCl2 100mM, búng nhẹ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Đặt ống tế bào trong đá 30 phút. - Ly tâm 3000v/p trong 10 phút.

- Hoà lại tế bào trong 60l CaCl2 100mM, búng nhẹ cho tan hết tế bào. - Để ống tế bào trên đá trước khi sử dụng tối thiểu 1h.

Biến nạp vào E. coli

- Trộn vector tái tổ hợp (khoảng 10-50 ng) với tế bào trong ống tế bào khả biến, sau đó để trên đá 30 phút.

- Sốc nhiệt ở 42 oC, 60 giây. Đặt trên đá 2 phút.

- Bổ sung 200l LB lỏng, nuôi lắc (200 v/p) ở 37 oC trong 1h.

- Cấy trải 100l dịch nuôi lên trên đĩa môi trường LB đặc chứa kháng sinh Amp (100 g/ml).

- Ủ đĩa ở 37 oC, qua đêm.

2.1.5. Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli

Nguyên tắc

Các tế bào vi khuẩn E. coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha dừng thì được ly tâm thu lại. Thành và màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt. Sau đó DNA hệ gen và protein được tủa và loại bỏ khỏi dịch DNA plasmid nhờ ly tâm. DNA plasmid được tủa lại bằng cồn.

Cách tiến hành

Nhặt các khuẩn lạc trắng cấy vào 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (100 µg/ml). Nuôi lắc qua đêm ở 37 oC, 200 v/p.

 Hút 1ml dịch nuôi qua đêm cho vào ống Eppendorf 1,5 ml.

 Ly tâm 6.000 v/p trong 5 phút thu tế bào.

 Bổ sung 150l Sol I, vortex để hòa tan tế bào.

 Bổ sung 150l Sol II, đảo nhẹ.

 Bổ sung 150l Sol III, đảo nhẹ.

 Bổ sung 450l Chloroform: Isoamylalcohol (24 : 1), đảo nhẹ.

 Chuyển toàn bộ dịch pha trên sang Eppendorf mới.

 Bổ sung một thể tích tương đương ethanol 100%, tủa DNA plasmid ở - 20 oC trong thời gian 2 giờ.

 Ly tâm 12.000 v/p trong 20 phút, thu cặn.

 Rửa cặn DNA bằng 500l ethanol 70%.

 Ly tâm 12.000 v/p, thu tủa.

 Làm khô DNA plasmid bằng máy Speed Vac.

 Hòa cặn DNA trong 40l H2O có bổ sung RNase (100 g/ml).

 Ủ ở bể ổn nhiệt 37 o

C trong 1 giờ để loại RNA.