2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Các phƣơng pháp thao tác với DNA
2.3.4. Sàng lọc dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên đích
Có rất nhiều phương pháp cố định tùy thuộc bản chất của đích cần sàng lọc. Kháng nguyên HER2 là phân tử protein có kích thước không lớn do đó dễ dàng được
hấp phụ trên bề mặt đĩa polystyrene. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn cách đơn giản để cố định các kháng nguyên trong quá trình sàng lọc và thu nhận kháng thể phage- scFv đặc hiệu kháng nguyên đích, cụ thể như sau:
Kháng nguyên được pha loãng trong PBS (10-100 ng) sau đó được phủ trên đĩa polystyrene qua đêm ở nhiệt độ phòng.
Để tránh phage liên kết không đặc hiệu với bề mặt, đĩa được phủ tiếp với dung dịch MPBS 2% sữa tách bơ và ủ ở 37 oC trong 2 giờ.
Rửa đĩa bằng PBS 3 lần sau đó cho hỗn hợp phage (đã nhân nuôi từ thư viện gốc Bacteriophage Griffin.1) vào các giếng.
Ủ đĩa 37 o
C trong 2h.
Sau đó rửa 3 lần bằng dung dịch TPBS (0.05% Tween 20 pha trong PBS), rửa tiếp 3 lần với dung dịch PBS.
Các phage gắn với kháng nguyên được giải hấp phụ bằng 1ml triethylamine 100mM trong 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó trung hoà bằng 0.5ml Tris-HCl, pH 7.5.
Dung dịch phage giải hấp phụ được ly tâm 10.000 v/p, thu dịch ly tâm. Dịch ly tâm này chứa các phage mang mảnh kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích đã cố định.
Các phage sau mỗi vòng sàng lọc sẽ được nhân nuôi trong tế bào TG1 để phục vụ cho các vòng sàng lọc tiếp theo.
Sau lần sàng lọc thứ 3 ái lực trung bình của các kháng thể phage-scFv được kiểm tra bằng ELISA với kháng thể cộng hợp kháng M13.