2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Các phƣơng pháp thao tác với DNA
2.3.9.3. Gắn kháng thể với hạt vàng
Thực hiện gắn kháng thể với hạt vàng theo quy trình của Beesley J (1989). Cụ thể các bước tiến hành như sau:
Hóa chất gồm: Aqua regia: 50% HCl và 50% HNO3; Deionized H2O; Borax: Na2B4O7.10H2O (2mM); NaCl (10%); BSA (10%); K2CO3 (100nM); HCl (100mM).
Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm: Cốc thủy tinh, que khuấy thủy tinh, ống nhựa ly tâm được rửa nhiều lần bằng nước cất sau đó được silicon hóa để chống dính. Máy đo phổ hấp thụ của dung dịch.
Chuẩn bị kháng thể đã đƣợc tinh sạch trên cột sắc ký ái lực
Pha kháng thể trong đệm 2mM borax tới nồng độ 0.1µg/µl. Thẩm tích dung dịch thu được ít nhất 4 giờ trong 1 lít đệm borax với pH=9. Ly tâm dung dịch kháng thể tốc độ 10.000g thời gian 1 giờ ở 4 oC, sau đó giữ ở 4 o
C cho tới khi sử dụng.
Trộn phức hợp BSA–AuNP (150 µg/ml) với các kháng thể có hoạt tính EDC (1 ml, 1013 CFU trong PBS) và cho hỗn hợp phản ứng trong 1h tại 4 oC; sau đó lắc hỗn hợp trên với tốc độ 200 v/p trong 1h ở 4 oC.
Phân tách phức hợp AuNP–Ab khỏi các kháng thể và AuNP còn thừa bằng ly tâm 12000 v/p tại 4 oC trong 400µl dung dịch chứa 20% PEG trong 15 phút (lặp lại bước ly tâm 2 lần). Phức hợp Au–Ab sẽ được tái pha loãng trong 100µl PBS.
Chuẩn độ dung dịch để xác định tỉ lệ kháng thể-hạt vàng (Ab-Au)
1. Chuẩn dung dịch hạt vàng tới pH 9. Dùng Pipette nhỏ giọt 500µl dung dịch hạt vàng vào dãy các ống ly tâm (1.5ml).
2. Điều chỉnh pH của dịch kháng thể (0.1 µg/µl) tới pH 9.2 với 100 nM K2CO3 hoặc 100mM HCl
3. Thêm kháng thể vào mỗi ống ly tâm chứa đệm theo dãy sau: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50. Cụ thể như sau:
Bảng 9. Chuẩn độ dung dịch để xác định tỷ lệ Ab-Au
Ab Buffer Ab Buffer Ab Buffer Ab Buffer Ab Buffer Ab Buffer
50 0 50 0 10 40 10 40 35 15 35 15 45 5 45 5 5 45 5 45 30 20 30 20 40 10 40 10 0 50 0 50 25 25 25 25 35 15 35 15 Borax 50 Borax 50 20 30 20 30 30 20 30 20 Water 50 Water 50 15 35 15 35 25 25 25 25 50 0 50 0 10 40 10 40 20 30 20 30 45 5 45 5 5 45 5 45 15 35 15 35 40 10 40 10 0 0 0 0
4. Thêm đệm vào mỗi ống chứa kháng thể để các ống đạt thể tích 1ml 5. Lắc đều, nhẹ các ống và để đứng khoảng 5 phút để tạo phức hệ Ab-Au. 6. Thêm vào mỗi ống ly tâm 100µl of 10% NaCl và lắc đều 1 phút.
7. Xác định độ hấp thụ và soi kính để đánh giá phức hệ Ab-Au tạo thành.