Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 KẾT QUẢ TẠO KHÁNG NGUYÊN HER2 TÁI TỔ HỢP
1.1. Kết quả tách dòng gen mã hóa kháng nguyên HER
Đoạn gen HER2 được khuếch đại bằng cặp mồi HER2R và HER2F từ RNA tổng số sau khi đã tổng hợp cDNA bằng phản ứng RT-PCR. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn gen HER2 mã hóa cho phần thụ thể ngoại bào của HER2. Mồi HER2F bao gồm 30 nucleotide, được thiết kế thêm trình tự nhận biết của enzyme NdeI và bộ ba mã khởi đầu ATG. Mồi HER2R có 25 nucleotide, được thiết kế thêm trình tự nhận biết của enzyme XhoI. Theo tính toán đoạn gen HER2 được nhân bản có chiều dài ~1,9 Kb. Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 0.8% và kết quả được thể hiện trên hình 17.
Trên ảnh điện di cho thấy, sản phẩm RT-PCR ở đường chạy số 1 xuất hiện một băng sáng đậm, rõ nét và so với thang DNA chuẩn thì có kích thước khoảng 1900 bp. Kết quả này phù hợp với kích thước của đoạn gen HER2 theo tính toán lý thuyết.
Như vậy, có thể chúng tôi đã nhân bản được đoạn gen HER2 mã hoá cho một phần thụ thể phát triển biểu mô ở người. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn đây có phải là đoạn gen HER2 hay không chúng tôi tiến hành tách dòng, xác định trình tự đoạn DNA được khuếch đại và so sánh sự sai khác với trình tự gen cùng loại đã công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế.
Đoạn DNA của gen mã hoá cho phần thụ thể ngoài màng của HER2 được nhân dòng bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pTZ57R/T của hãng Fermentas nhờ enzyme nối T4-DNA ligase. Phản ứng được thực hiện ở 22 oC trong 16
Hình 17. Điện di đồ kết quả RT-PCR M: Marker DNA 1Kb (Fermentas) 1: Sản phẩm RT-PCR đoạn gen HER2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giờ. Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector gắn với sản phẩm RT-PCR mang đoạn gen mã hóa cho phần thụ thể ngoài màng của HER2. Hỗn hợp ghép nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli TOP10 (hình 18). Tiếp đó tiến hành chọn lọc, tách chiết DNA plasmid để chọn những dòng vector tái tổ hợp mang đoạn gen mong muốn.
pTZ57R/T là vector tách dòng có độ dài 2886 bp, có số lượng bản sao lớn khi được biến nạp vào tế bào E. coli. Ngoài ra trên vector tách dòng này, ở vùng đa vị cắt còn có trình tự gen lacZ, mã hóa cho enzyme β-galactosidase. Do đó những plasmid đã được gắn đoạn gen ngoại lai vào thì sẽ làm thay đổi cấu trúc và làm bất hoạt gen tạo β-galactosidase. Do vậy, những vi khuẩn không chứa plasmid tái tổ hợp (chỉ chứa plasmid pTZ57R/T tự đóng vòng) sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh, nên trong môi trường có chất cảm ứng IPTG thì enzyme β-galactosidase sẽ được tổng hợp. Enzyme này sẽ phân huỷ cơ chất X-gal thành dẫn xuất indol, một dẫn xuất khi ở ngoài môi trường sẽ bị oxi-hoá cho màu xanh. Vì vậy, các khuẩn lạc xanh là những vi khuẩn không mang vector tái tổ hợp. Nếu sản phẩm PCR gắn được vào vector tách dòng thì nó sẽ gắn xen vào vị trí giữa gen lacZ và làm bất hoạt gen này. Do đó, enzyme β-galactosidase sẽ không được tạo ra, X-gal trong môi trường sẽ không bị phân huỷ và sẽ không tạo nên dẫn xuất indol. Khuẩn lạc hình thành sẽ có màu trắng. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen mong muốn. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn nhẫu nhiên một số khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy kiểm tra biến nạp để nuôi cấy, tách plasmid, cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn để xác định dòng có mang đoạn gen HER2.
Hình 18. Kết quả biến nạp vector pTZ57R/T-HER2 vào E. coli TOP10