2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Các phƣơng pháp thao tác với DNA
2.1.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Nguyên tắc
DNA tích điện âm có khả năng chuyển động trong điện trường theo chiều từ cực âm đến cực dương. Tốc độ chuyển động của chúng trong điện trường có hiệu điện thế không đổi phụ thuộc hai yếu tố dạng tồn tại của DNA và kích thước DNA. Các DNA có kích thước càng lớn thì chuyển động càng chậm, các DNA dạng siêu xoắn chuyển động nhanh hơn DNA dạng thẳng.
Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose, kích thước phân tử tuyến tính với quãng đường dịch chuyển của DNA trên gel agarose. Thường các đoạn gen có kích thước từ 300-10.000 bp có thể được phân tách trên gel agarose 0.8%. DNA trên gel agarose được phát hiện bằng cách nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và quan sát dưới tia UV.
Cách tiến hành
Chuẩn bị gel agarose 0.8%: cân 0.8g bột agarose hòa vào100ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun nóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50 oC, đổ vào khuôn đã đặt sẵn răng lược với độ dày thích hợp. Để bản gel đông lại và ổn định hoàn toàn. Gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di chứa sẵn dung dịch đệm TAE 1X sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.
Tra mẫu: lấy 1 thể tích dung dịch chứa DNA thích hợp (chứa khoảng 1-2µg DNA), trộn với màu và tra vào các giếng của bản gel.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Điện di: chạy điện di ở hiệu điện thế cố định 100V, quan sát sự di chuyển của màu để biết khi nào thì dừng lại. Thông thường sẽ dừng lại khi chất chỉ thị màu chạy được khoảng 2/3 chiều dài bản gel.
Phát hiện các băng DNA: bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml trong khoảng 5 phút, sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước cất rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng 360nm