4.1. Giới thiệu chung
Kỹ thuật biểu lộ trên phage (phage display) do G. Smith mô tả năm 1985 là kỹ thuật biểu lộ các phân tử peptide hay protein trong đó có cả các phân tử kháng thể được biểu lộ trên bề mặt thực khuẩn thể hình sợi (filamentous bacteriophage).
Nguyên tắc của kỹ thuật này là trình tự DNA mã hóa cho protein quan tâm được gắn vào vị trí xác định trên hệ gen của thực khuẩn thể hình sợi, do đó mà protein nó mã hóa được biểu hiện và “bộc lộ” trên bề mặt dưới dạng sản phẩm gắn kết với một trong các loại protein vỏ của thực khuẩn thể [2]. Do đó, thư viện thực khuẩn thể chứa tới vài tỷ các biến thể được sử dụng thay cho việc sử dụng công nghệ gen để tạo ra từng phân tử protein hoặc peptide khác nhau.
Điều đặc biệt của phage display là sự liên kết kiểu hình của protein hoặc peptide với kiểu gen của nó được đóng gói trong cùng một thực khuẩn thể. Sau khi sàng lọc và chọn được các kiểu hình (các phân tử kháng thể được bộc lộ trên bề mặt hạt phage) có ái lực cao đối với kháng nguyên đích có thể thu nhận được gen mã hóa cho nó.
4.2. Thực khuẩn thể M13 Cấu tạo Cấu tạo
Cấu trúc của virus M13 đã được nghiên cứu kỹ (minh họa trên hình 12). M13 kiểu dại có đường kính 65Å và dài 9300Å. Hạt virus chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính pVIII. Mỗi đầu của phage
được bao bởi 2 protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và pVI. Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI [30].
Chu kỳ sống
Quá trình xâm nhiễm bắt đầu khi phage tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua tương tác giữa pIII với tiêm mao F của E. coli. Sau đó phage chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ và các protein vỏ gắn với màng vi khuẩn [41]. Bên trong vi khuẩn bộ gen của phage chuyển thành DNA mạch kép nhờ các enzyme của vi khuẩn và bắt đầu tổng hợp 11 protein của M13 (hình 13).
Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tích lũy đủ trong vi khuẩn bị nhiễm quá trình lắp ráp hạt virus bắt đầu. Các protein cấu trúc pVIII, pVII, pIX, pVI và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ gen DNA mạch đơn tái bản. Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng hợp của phage và ngăn cản sự chuyển hóa nó thành DNA mạch kép. Sau đó hạt virus lắp ráp và được đẩy ra khỏi vi khuẩn. Một chú ý quan trọng là M13 là thực khuẩn thể không sinh tan nên tế bào chủ không bị chết sau khi nhiễm [30].
Hình 12. Cấu trúc của thực khuẩn thể M13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4.3. Tạo thƣ viện phage display
Về cơ bản, để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen chuỗi nặng chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid để có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của phage [30].
Để có thể bộc lộ các peptide hoặc protein sử dụng hệ thống phagemid, bổ sung helper phage vào canh trường vi khuẩn mang DNA phagemid để tạo ra hạt virus sử dụng trong sàng lọc. Khi nhiễm vào vi khuẩn mang phagemid, bộ gen của helper phage bắt đầu tổng hợp tất cả các protein của phage kiểu dại. Khi quá trình lắp ráp phage bắt đầu, các hạt virus ưu tiên sử dụng DNA phagemid hơn là DNA của helper phage vì nó mang tín hiệu đóng gói đầy đủ chức năng.
Các hạt phage được tiết ra sẽ biểu lộ trình tự ngoại lai trên protein vỏ và mang phagemid mã hóa trình tự này [30]. Một số thư viện đã được tạo ra và sử dụng phổ biến là Nissim Library, được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Dr G. Winter tại Cambridge (1994), và thư viện của De Kruif và cs (1995) [42]. Nổi bật nhất là thư viện tổng hợp Fab và scFv do Griffiths và cs tạo ra [65].
4.4. Sàng lọc với thƣ viện phage
Hầu hết các thủ tục sàng lọc dựa trên nguyên lý chọn lọc ái lực và gồm các bước cơ bản sau: 1) khuếch đại thư viện và tạo phage; 2) cho phage tiếp xúc với đích; 3) loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa; 4) tách phage gắn và 5) tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ để khuếch đại chúng lên (hình 14). Các vòng sàng lọc này sau đó được lặp lại nhiều lần.