Phép thử hóa học

2. Ngộ độc nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP)

2.2.5. Phép thử hóa học

Kỹ thuật đo huỳnh quang và đo màu

Sự oxy hóa kiềm của các độc tố PSP sinh ra các sản phẩm phát huỳnh quang, đặc tính này cho phép xác định một cách đơn giản với việc sử dụng kỹ thuật đo huỳnh quang (Bates và Rapoport, 1975; Bates và các cộng sự, 1978). Tuy nhiên, các kỹ thuật như vậy vẫn bị ảnh hưởng bởi một vài biến động. Việc điều chỉnh pH khi chiết và trước khi oxy hóa là cần thiết, cần rửa sạch cột trao đổi ion để loại bỏ các chất kéo theo trong quá trình chiết gây nhiễu, và sự có mặt của một vài kim loại có thể ảnh hưởng đến sự oxy hóa và năng suất phát huỳnh quang. Hơn thế, các độc tố thể hiện khả năng phát quang ở các mức độ không giống nhau, cụ thể như sự phát quang của một vài độc tố carbamate là rất yếu. Một cách để loại bỏ sự cố nêu trên là ứng dụng nhiều phép thử phát huỳnh quang và đo màu trên cùng một loại mẫu. Phép thử phát huỳnh quang đã được công bố là có mức độ nhạy cao hơn sau đó là đến phép thử so màu và cuối cùng phép thử trên chuột được cho là có độ nhạy thấp hơn cả (Mosley và các cộng sự, 1985).

Hungerford và các cộng sự (1991) đã tự động hóa phương pháp phát huỳnh quang bằng cách sử dụng phương pháp phân tích tiêm dòng. Phương pháp cho phép điều chỉnh tự động phát quang nền và khảo sát nhanh các mẫu nhuyễn thể về sự có mặt của các độc tố PSP.

Các kỹ thuật sắc ký

Các kỹ thuật dựa trên sắc ký lỏng đang là các phương pháp không gắn với các phép thử sinh học được sử dụng rộng rãi nhất để xác định các hợp chất của PSP. Trong suốt thập kỷ qua các nhà khoa học đã có những nỗ lực đáng kể trong việc phát triển một phương pháp sắc ký lỏng theo hướng tự động hóa để phân tích các độc tố PSP theo thường quy. Nhìn chung các phép thử dựa trên việc phân tách các độc tố bằng sắc ký tương tác ion và sử dụng phản ứng sau cột để oxi hóa và sinh ra các dẫn xuất có thể xác định được một cách dễ dàng. Phương pháp luận được phát triển bởi Cục Quản lý Lương thực và Dược phẩm của Hoa kỳ đã báo cáo khả năng phân tích được 12 độc tố PSP carbamate và sulfocarbamoyl (Sullivan, 1988). Phương pháp luận đã được xác định giá trị sử dụng đối với phép

25

thử trên chuột và nói chung sự tương quan giữa các kỹ thuật là tốt (r>0,9) (Sullivan, 1988). Nhìn chung các giới hạn phát hiện thấp hơn giới hạn phát hiện của phép thử sinh học trên chuột. Trên thực tế, các phương pháp của Sullivan (1988) đã chỉ ra những khó khăn trong việc phân tách STX từ dcSTX (Van Egmond và các cộng sự, 1994) và vì vậy các phòng thí nghiệm của Châu Âu không sử dụng nó để phân tích PSP.

Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng đã tạo ra được một bước tiến có ý nghĩa, hệ thống này lại đòi hỏi những yêu cầu đáng kể về kỹ năng, thời gian chuyên biệt để thực hiện nó trong đời sống thường ngày. Hơn nữa, các kỹ thuật sắc ký lỏng không phải là không có sự cố. Thielert và các cộng sự (1991) đã chỉ ra rằng các độc tố 6-decarbamoyl không thể phân tích được bằng phương pháp của Sullivan (1988). Việc phân tích được cải thiện bằng cách phân tích liên tục các mẫu có sử dụng dung dịch đệm khác nhau và các hệ thống thuốc thử cặp ion. Ledoux và các cộng sự (1991) đã mô tả sự cố gặp phải khi phân tách các độc tố nhóm C với các chất phát huỳnh quang có trong vẹm không chứa độc tố. Waldock và các cộng sự (1991) cũng báo cáo rằng kỹ thuật sắc ký lỏng đã không đủ nhanh hoặc nhạy để xử lý với một số lượng lớn mẫu được đem phân tích tại thời điểm bùng phát hiện tượng nở hoa của tảo.

Sự phân bố dàn trải của các pic cũng là một vấn đề nảy sinh gây nên bởi thể tích khá lớn của hệ thống ống phản ứng sau cột. Một phương pháp để giải quyết vấn đề này được đặt ra là chuẩn bị các dẫn xuất phát huỳnh quang trước khi phân tách LC (Lawrence và Menard, 1991; Lawrence và các cộng sự, 1991a), nhưng không phải là tất cả các độc tố PSP đã biết đến đều được phân tách bởi phương pháp này vì có vài độc tố đã biết (ví dụ như GNTX2 và GNTX3) lại tạo thành cùng một sản phẩm oxy hóa.

Hơn nữa, để định lượng chính xác thì cần hiệu chuẩn hệ thống một cách thường xuyên bằng cách sử dụng các dung dịch tiêu chuẩn của các độc tố. Đó là do sự khác biệt về hóa học của mỗi độc tố PSP mà dẫn đến các tốc độ oxy hóa khác nhau của mỗi hợp chất trong phản ứng sau cột. Cho đến gần đây mới chỉ có chất chuẩn STX có sẵn trên thị trường và không thể xác định chính xác số lượng của các độc tố PSP khác trong hỗn hợp. Đến năm 2003, đã có bán sẵn các chất chuẩn được chứng nhận như STX, neoSTX, GNTX 1-4, GNTX 2/3 và GNTX 5 (Laycock và các cộng sự, 1994; NRC, 2003), và sự có mặt của các chất chuẩn này đã cải thiện một cách đáng kể các số liệu thu được nhờ phương pháp LC (Wright, 1995). Các nhà nghiên cứu nên thận trọng khi thay đổi chất chuẩn này sang chất chuẩn khác vì khi ấy sẽ xảy ra sự không liên tục của số liệu. Sự khác nhau giữa các nồng độ STX của ba nhà cung cấp khác nhau lên đến 20 phần trăm đã được thông báo (Quilliam và các cộng sự, 1999).

Phương pháp LC đã được sử dụng (cùng với phép thử sinh học trên chuột, xem phần 2.2.2) trong một nghiên cứu thử nghiệm về các độc tố PSP trong vẹm

26

đông khô được tổ chức bởi Kế hoạch Đánh giá Hiệu quả Phân tích Thực phẩm (FAPAS®) năm 2003 (Earnshaw, 2003). Mười lăm phòng thí nghiệm đã tham gia vào nghiên cứu này và bảy trong số đó đã sử dụng phương pháp LC. Thực tế thì tất cả các phòng thí nghiệm đã phân tích trên vật liệu thí nghiệm để xác định STX và dc STX, một vài phòng thí nghiệm còn xác định cả neoSTX; GNTX1/4;

GNTX2/3; GNTX5, GNTX6, C1/2 và C3/4. Các kết quả STX nằm trong khoảng từ không xác định đến 83 mg/100g (trọng lượng chất tươi), kết quả dcSTX nằm trong khoảng từ 25 đến 130 mg/100g. Thực ra các vật liệu thí nghiệm chứa STX<3,5 mg/100g và dcSTX80 mg/100g. Một nghiên cứu về các quy trình phân tích đã được sử dụng chỉ ra rằng các phòng thí nghiệm xác định được các kết quả STX dương tính đều sử dụng HCl có đun sôi trong bước chiết rút (như là trong phép thử trên chuột theo qui trình của AOAC) (Hollingworth và Wekell, 1990).

Ngược lại, các phòng thí nghiệm mà sử dụng axit axetic không đun sôi trong bước chiết rút đều khó phát hiện hoặc không phát hiện ra saxitoxin. Lý do dẫn đến điều này là do việc chiết bằng HCl có đun sôi dẫn đến thủy phân một phần các độc tố nào đó làm chuyển một vài độc tố PSP thành các chất tương tự nhưng độc hơn (ví dụ: GNTX5 bị chuyển thành STX). Sử dụng axit axetic không đun sôi là một qui trình chiết rút nhẹ hơn mà giữ lại đặc tính độc của mẫu ban đầu. Các mẫu được sử dụng trong nghiên cứu của FAPAS đã không chứa STX nhưng chúng đã chứa GNTX5. Nhận thức rõ về hiện tượng này cũng như việc tiêu chuẩn hóa phương pháp luận là cần thiết để giải quyết vấn đề này và có thể đưa đến một sự tương đồng tốt hơn trong kết quả phân tích như đã được chứng minh giải thích trong một nghiên cứu của Hà Lan (Van Egmond và các cộng sự, 2004).

Một dự án đã được thực hiện từ năm 1993 đến năm 1997 trong khuôn khổ của Chương trình Kiểm tra, Đo lường và Tiêu chuẩn của Ủy ban Châu Âu (SMT) (Trước đây được gọi và được biết đến như là Văn phòng Chứng nhận chung hay BCR) để phát triển các vật liệu tham khảo liên quan tới nhuyễn thể chứa các độc tố PSP đã được chứng nhận. Dự án đã được thực hiện bởi 13 phòng thí nghiệm do chính quyền đề cử và sáu trường đại học, đại diện cho năm quốc gia sản xuất nhuyễn thể chủ yếu trong Liên minh Châu Âu (EU) và một nước thành viên Châu Âu khác mà có quan tâm đến vấn đề xác định PSP. Một nghiên cứu sơ bộ được thực hiện bởi một số phòng thí nghiệm liên hợp cho thấy có đủ cơ sở cho việc phát triển các nguồn vật liệu tham khảo (Van Egmond và các cộng sự, 1994).

Chương trình nghiên cứu này có liên quan đến:

- Các nghiên cứu nhằm cải thiện và đánh giá hệ phương pháp hóa học, -Việc nhận diện và xác định độ tinh sạch của các chất chuẩn PSP và sự ổn định của chúng trong dung dịch;

- Hai nghiên cứu so sánh giữa các phương pháp phân tích

- Việc chuẩn bị các vật liệu tham khảo, bao gồm tính đồng nhất và các

27

nghiên cứu về sự ổn định;

- Sự sử dụng có hiệu quả giấy chứng nhận

Lúc đầu các phòng thí nghiệm được đề nghị phân tích các dung dịch STX và các dịch chiết nhuyễn thể có chứa PSP bằng phương pháp tự chọn nhưng cuối cùng trong nghiên cứu cấp giấy chứng nhận thì chỉ sử dụng các phương pháp LC phân bố trước hoặc sau cột. Dự án đã được hoàn thành bằng một báo cáo về việc cấp giấy chứng nhận cho STX và dcSTX trong hai vật liệu vẹm tham khảo (BCR- CRMs 542 và 543) bao gồm việc nhận diện một vài độc tố PSP khác, và qui trình bổ sung chất dựa trên một dung dịch làm giàu (CRM 663) với một nồng độ STX đã được xác nhận (Van Egmond và các cộng sự, 1998; Van den Top và các cộng sự, 2000, 2001).

Hai phương pháp được sử dụng trong dự án SMT đã chỉ ra các đặc tính thực hiện tốt (Lawrence và Menard, 1991; Franco và Fernandez, 1993) đã được chọn lựa cho việc tiêu chuẩn hóa bởi Ủy ban Châu Âu về Tiêu chuẩn hóa (CEN).

Trong thời gian của dự thảo, phương pháp Franco đã xuất hiện như một bộ tiêu chuẩn ban hành trước các tiêu chuẩn chính thức của Châu âu (CEN, 2002a) và phương pháp Lawrence được coi như là tiêu chuẩn dự thảo của Châu âu (CEN, 2002b). Phương pháp sau đã thành công và đã được ứng dụng trong một nghiên cứu chuyên biệt về PSP trong nhuyễn thể được thực hiện ở Hà Lan vào năm 2001 ở cấp quốc gia (Van Egmond và các cộng sự, 2004). Phương pháp này cũng được chỉnh sửa thêm bởi Lawrence và việc chỉnh sửa đã được đánh giá vào năm 2002 trong một nghiên cứu cộng tác quốc tế (Lawrence và các cộng sự, 2003).

Các kỹ thuật điện di Điện di bản

Các phương pháp khác nhau để phân tách các độc tố PSP đã được phát triển có sử dụng hiện tượng điện di trên giấy và gel (Boyer và các cộng sự, 1979;

Onoue và các cộng sự, 1983; Ikawa và các cộng sự, 1985; Thibault và các cộng sự, 1991). Được sử dụng trong từng đợt và ở một mức độ đơn giản, kỹ thuật này cho phép khảo sát nhanh đồng thời nhiều mẫu. Tuy nhiên, sự định lượng xem ra là khó khăn, và phần lớn các phương pháp đều sử dụng bơm peroxyt và một đèn UV để xác định các độc tố trên đĩa điện di. Phương thức này có lẽ được kỳ vọng phát triển trong tương lai tiến tới sử dụng máy đo huỳnh quang (Van Egmond và các cộng sự, 1993).

Hiện tượng điện di mao dẫn

Hiện tượng điện di mao dẫn (CE) là một kỹ thuật tương đối mới và đến nay đã có một số ứng dụng trong lĩnh vực phân tích độc tố, tuy nhiên tính linh hoạt của hệ thống CE đã cho thấy rằng nó sẽ là một lĩnh vực nghiên cứu đầy hứa hẹn. Về bản chất, kỹ thuật này sử dụng một mao quản silic đioxyt hẹp (~100 mm id) tại vị trí của gel điện di và lượng nanolit mẫu được đưa vào cuối cột trước khi nó được

28

sử dụng làm cầu nối hai dung dịch đệm. Các độc tố di chuyển qua cột khi có điện thế cao và có thể được phát hiện khi chúng đi qua ngăn phát UV hoặc huỳnh quang. Kỹ thuật này có khả năng ứng dụng cho nhiều loại hợp chất có tính dễ biến đổi điện di và thậm chí ở nơi không có tích điện cuối cùng xảy ra thì nó có thể giữ các hợp chất trong mixen mà sau đó có thể di chuyển.

Wright và các cộng sự (1989) đã dùng hệ thống CE kết nối với đầu dò huỳnh quang laser để xác định các chất chuẩn STX. Kỹ thuật này cho phép phát hiện STX ở mức 1 mg/kg. Thậm chí với thể tích tiêm vào rất nhỏ (1 đến 10 nl), các giới hạn phát hiện lý thuyết cho các mẫu nằm trong khoảng mg/kg. Điều trở ngại hiện nay cho kỹ thuật này đó là sự phân tách như nhau đã không thực hiện được cho các mẫu sinh vật có các độc tố bị pha trộn, thiết bị không sẵn có và đắt, và phương pháp này có cùng một vấn đề như phương pháp LC đó là dẫn xuất phát huỳnh quang phải được chuẩn bị trước khi phân tách hoặc phát hiện.

Thibault và các cộng sự (1991) đã ứng dụng phương pháp CE cho các mẫu sinh vật biển. Đã phân tách được neoSTX và STX và đã chứng minh là khi sử dụng phép đo phổ UV thì giới hạn phát hiện là 5 mM (xấp xỉ 1,5 mg/ml). Các tác giả đề nghị rằng kỹ thuật CE-UV có tiềm năng đáng kể cho việc khảo sát thường nhật các độc tố này trong dịch chiết tự nhiên, nhưng các giới hạn phát hiện hiện nay xem ra quá cao để sử dụng trong các chương trình giám sát.

Phép đo khối phổ

Việc ứng dụng của phép đo khối phổ trong lĩnh vực độc tố sinh học biển đã được xúc tiến trong suốt hai thập kỷ vừa qua không chỉ bởi sự phát triển của kỹ thuật kết hợp LC-MS mà còn bởi sự kết hợp của sự phân tách, phát hiện và công nghệ máy tính. Chìa khóa cho sự phát triển và thành công của LC-MS (bao gồm LC mắc nối tiếp MS) là năng suất, độ tin cậy, khả năng đáp ứng và tính sẵn có dễ mua của hệ thống (Willoughby và các cộng sự, 1998).

Vào cuối những năm 1980, Quilliam và các cộng sự (1989) đã báo cáo việc xác định STX bằng LC-MS có áp dụng ion-sprayTM như là kỹ thuật ion hóa, đây là một cái tên thương mại hóa để mô tả bơm điện nhờ khí nén (Sparkman, 2000).

Trong việc ghi ion đơn lẻ (kiểu SIM) và tập trung trên các ion dương, một giới hạn xỏc định 0,1 àM (1 àL tiờm vào) đó được ước lượng từ phõn tớch dũng chảy nhạy gấp năm lần so với phép thử sinh học trên chuột của AOAC. Quang phổ quét toàn bộ đã xác định được 100 ng STX, cũng như quang phổ của ion được sinh ra (ion con) của phân tử được thêm proton đơn ([M+H]+), cung cấp thông tin hữu ích cho việc xác nhận tính đồng nhất và sự phát triển của phương pháp SRM.

Pleasance và các cộng sự (1992a) đã báo cáo về việc phân tích các độc tố PSP bằng phương pháp LC-MS và CE-MS. Phương pháp LC-MS (kiểu SIM và quét toàn bộ- kiểu MS1) đã được sử dụng để giám sát sự tinh chế STX được phân lập từ các dịch chiết của tế bào tảo giáp. Thêm vào đó, quang phổ khối gắn cái nối

29

tiếp (MS2) đã được sử dụng để cung cấp thông tin về cấu trúc. Nó dường như là cú khả năng phỏt hiện 10pg được tiờm vào, tương đương với nồng độ 0,03 àM.

Việc cải tiến đạt được khi thay đổi pha động kết hợp với tốc độ lưu lượng giảm.

Đường cong tính toán đã được đưa ra cho các dung dịch tiêu chuẩn (ngoại suy) ở một khoảng nồng độ có tỷ lệ là 55 (nồng độ cao nhất/nồng độ thấp nhất). Măc dù, cho hình ảnh trông tốt nhưng thiếu các giá trị của các chỉ số về sự tuyến tính và sự lặp lại (lần lượt là r2 và s.d.). Khả năng ứng dụng của Phân tích Tiêm Dòng (FIA) để xác định các độc tố PSP trong các dịch chiết của sinh vật biển phức tạp hơn cũng đã được tranh luận rõ ràng. Nó đã được đánh giá là có những hạn chế trầm trọng.

Quiliam và các cộng sự (1993) đã báo cáo trong một nghiên cứu LC-MS với các khía cạnh định tính. Nghiên cứu đã tập trung trên các đặc tính của các sản phẩm oxy hóa của các độc tố PSP. Quang phổ khối của vài sản phẩm oxy hóa (quang phổ - phần lớn MS1) đã thu được, tuy nhiên tính nhạy (sự phản ứng tương ứng) đã giảm nhiều so với các độc tố ban đầu, và các tác giả đã kết luận rằng

“Toàn bộ tính nhạy của oxy hóa trước cột kết hợp với LC/MS sẽ không phải là phương pháp cạnh tranh để phân tích các độc tố PSP dạng vết”.

Jaime và các cộng sự (2001) đã đề cập một phương pháp định lượng sử dụng sắc ký trao đổi ion kết nối với sự ion hóa bụi điện tử (ESI) và quang phổ khối. Sự phân tách sắc ký đã đạt được bởi phép tách rửa gradient. Các phép đo đã được thực hiện kiểu SIM. Các hệ thống tự động đã được mô tả. Điểm trọng tâm là các giới hạn xác định (LOD) và tính tuyến tính; “các giới hạn xác định cho từng độc tố PSP đã được so sánh với các giới hạn xác định của các phương pháp khác dựa trên sắc ký cặp ion với sự oxy hóa và sự phát hiện huỳnh quang”, và phù hợp tốt để xác định các độc tố của PSP trong các vật liệu sinh học ( giới hạn qui định được đưa ra cho vẹm và nhuyễn thể là 800 àg PSP/kg). Tớnh tuyến tớnh đó được chứng minh bởi các hệ số tương quan tốt (>0,99). Tuy nhiên khoảng nồng độ chuẩn vẫn tồn tại những giới hạn nhất định (trung bình xấp xỉ mười).

Quilliam và các cộng sự (2001; 2001) đã trình bày một vài phương pháp LC-MS để xác định các độc tính của PSP, đặc biệt phương pháp sử dụng sắc ký lỏng tương tác hút nước kết nối với ion hóa bơm điện phổ khối mắc nối tiếp với phổ khối (HILIC-ESI-MS/MS). Các tác giả muốn có một phương pháp mà xác định được tất cả các độc tố PSP trong một lần chạy phân tích đơn. Cho đến bây giờ, các phương pháp đã được giới thiệu nhưng chưa được công bố.

Oikawa và các cộng sự (2002) đã sử dụng LC-MS để xác nhận sự tích lũy các độc tố PSP (GNTXs và các độc tố C) trong phần ăn được của cua. Mô tả định lượng bằng LC-MS đã không được báo cáo. Sự làm sạch một phần đã được thực hiện cho các phân tích ESI-MS, đó là sự xử lý thành công với than hoạt tính và một cột gel sinh học P2.

Tóm lại, trong lĩnh vực phân tích độc tố PSP, các bài báo về LC-MS chủ