5. Ngộ độc thần kinh (NSP)
5.2.1 Phương pháp sinh học
199
Phép thử sinh học trên chuột
Phép thử sinh học trên chuột bao gồm việc đánh giá độc tính bằng cách tiêm lipid thô trích ly từ nhuyễn thể vào phúc mạc (màng bụng) của chuột. Các kết quả được biểu thị bằng đơn vị chuột (mouse unit – MU) (Hokama, 1993). Một MU được định nghĩa là lượng độc tố thô trung bình sẽ giết chết 50% con chuột thí nghiệm (20 g chuột) trong 930 phút (Dickey và cộng sự, 1999). Phương pháp hiện đang được sử dụng được Hiệp hội Y tế công cộng Mỹ (APHA) công nhận từ năm 1985 dựa trên việc trích ly diethylether của mô nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Sau sự phát hiện của NSP tại New Zealand vào năm 1993, một chiến lược quản lý để giám sát độc tố NSP được phát triển bởi cơ quan pháp quy MAF. Phương pháp chuẩn bị mẫu được sử dụng dựa trên việc tách chiết bằng acetone các thành phần lipophilic tiếp theo đó là quá trình phân tách vào trong dichloromethane. Phương pháp này rất hiệu quả trong việc tách chiết các độc tố không xác định tan trong chất béo từ các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố NSP và thể hiện những lợi thế nhất định khi so sánh với phương pháp phân tích của APHA (đơn giản và phù hợp hơn cho việc tách chiết nhanh các pha lỏng và phân tách các hợp chất hữu cơ, hiệu quả tách chiết cũng cao hơn). Tuy nhiên, sau khi phát hiện ra một hợp chất có hoạt tính sinh học mới (gymnodimine) sản sinh bởi loài tảo Gymnodinium mikimotoi, một loài phổ biến trong các vùng nước tại New Zealand trong thời gian xảy ra các vụ ngộ độc thần kinh, các nhà chức trách đã quay lại dùng phương pháp tách chiết diethylether của APHA. Gymnodimine không thể chiết bởi diethylether nhưng nó làm cho chuột chết rất nhanh khi phương thức dichloromethane được sử dụng. Bởi vì gymnodimine không bị coi là gây nguy hiểm cho sức khỏe con người, nên các chương trình giám sát hiện đang sử dụng phương pháp tách chiết diethylether như một phương tiện phân biệt hoạt động của gymnodimine với độc tính NSP (Fernandez và Cembella, 1995).
Về cơ bản, khi phát hiện sự có mặt của brevetoxins ở bất kỳ mức độ nào trong 100g mô nhuyễn thể hai mảnh vỏ đã được coi là không an toàn cho con người. Trong thực tế, dư lượng độc tố ≥20 MU trong 100g mô nhuyễn thể hai mảnh vỏ được chấp nhận, và vẫn là liều lượng hướng dẫn cho việc có cấm thu hoạch các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ hay không (Dickey và cộng sự, 1999)
Một số hạn chế của phương pháp thử nghiệm trên chuột là nó đòi hỏi một lượng lớn chuột thí nghiệm, đồng nghĩa với việc phải dùng một lượng lớn chất chiết xuất từ mô, nhưng lại cho kết quả thiếu khách quan và đặc trưng (Hokama, 1993)
Phép thử sinh học trên cá
Phép thử trên cá Mosquito (Gambusia affinis) được thực hiện trong 20ml nước biển (độ mặn 3,5%), cho vào mỗi bình một con cá và cho thêm vào mỗi bình đó 0,01ml ethanol. Mỗi LD50 đã được xác định bằng cách chuẩn bị 3 lần lặp của các dung dịch pha loãng (hệ số pha loãng bằng 2) cho mỗi loại độc tố. Tỷ lệ chết
200
được đánh giá sau 60 phút và liều gây chết trung bình được xác định bằng cách sử dụng các bảng trong Weil từ năm 1952 (Baden và cộng sự, 1988). Các thử nghiệm trên cá thường được dùng để xác định khả năng ô nhiễm của nước biển hay để tách chiết các độc tố thô hoặc đã được tinh sạch (Viviani, 1992).
Các phép thử trong ống nghiệm Phép thử trên tế bào thần kinh
Các độc tố gây ngộ độc thần kinh thể hiện các ảnh hưởng độc hại của chúng bằng cách liên kết với một vị trí nhất định của các cơ quan thụ cảm còn gọi là các kênh ion Na+ nhạy cảm với điện áp. Điều này tương tác rất đặc biệt với các cơ quan thụ cảm tự nhiên tạo cơ sở cho thí nghiệm trên tế bào thần kinh. Bất kỳ sự thay đổi nào của phân tử độc tố mà cản trở liên kết của nó với cơ quan thụ cảm và vì vậy gây cản trở đến sự phát hiện của nó trong một thử nghiệm trên cơ quan thụ cảm cũng sẽ đưa đến khả năng tạo ra một phản ứng độc hại. Và do vậy các phát hiện ở đây là dựa trên hoạt động chức năng của nguyên tử độc tố hơn là dựa vào thành phần cấu trúc của nó, cũng giống như các trường hợp thử nghiệm kháng thể.
Hơn nữa, ái lực của một độc tố với các thụ thể của nó thì tỷ lệ thuận với độc tính của độc tố đó. Vì vậy, đối với một hỗn hợp cùng loại, thử nghiệm dựa trên thụ quan sẽ đưa ra một phản ứng đại diện cho độc lực tổng hợp của các độc tố có mặt (Cembella và cộng sự, 1995)
Một kỹ thuật nuôi cấy mô bằng cách sử dụng một dòng tế bào u nguyên bào thần kinh chuột (Neuro-2a) đã được phát triển cho thử nghiệm tại vị trí thứ 5 trên kênh Na+ kích hoạt các độc tố a. o. brevetoxins. Phương pháp phát hiện này được dựa trên việc xác định điểm cuối của dehydrogenase ty thể. Giới hạn phát hiện của PbTx là 0,25 ng/10 àl chiết xuất mụ. PbTx cú thể được phỏt hiện trong vũng 4-6 giờ nhưng giới hạn phát hiện có thể được giảm với thời gian ủ ấm khoảng 22 giờ.
Phương pháp này được tiếp tục sửa đổi và đơn giản hóa bằng cách kết hợp một phương pháp so màu dựa trên chức năng của các tế bào hoạt động trao đổi chất để giảm một hợp chất tetrazolium là MTT (=3-[4,5-dimethylthiazol-2-YL] -2,5- diphenyltetrazolium) thành một sản phẩm màu xanh-màu formazan (Mange và cộng sự, 1993;1995).
Các phương pháp khác đã sử dụng XTT (một loại thuốc thử formazan hòa tan) để xác định đo màu (Yasumoto và cộng sự, 1995). Các xét nghiệm tế bào u nguyên bào thần kinh có thể được sử dụng để phát hiện brevetoxins trong mô nhuyễn thể hai mảnh vỏ bị nhiễm độc nhưng xét nghiệm này không thể phân biệt các cá thể brevetoxins khác nhau (Hua và cộng sự, 1995).
Fairey và cộng sự (1997) báo cáo đã tiếp tục sửa đổi phương pháp thử nghiệm liên kết thụ quan trong tế bào u nguyên bào thần kinh xây dựng bởi Manger và các cộng sự (1995) thành thử nghiệm gen chỉ thị sử dụng thế hệ ánh sáng xúc tác luciferase như là một nút ngoại vi và một lumen kế microplate để
201
định lượng. Một gen chỉ thị cấu tạo c-Fos-luciferase đã thể hiện sự ổn định trong bản sao N2A của các tế bào u nguyên bào thần kinh chuột, các thông số thử nghiệm đã được tối ưu hóa và sự nhạy cảm của thử nghiệm gen chỉ thị này đối với một số độc tố tảo, loại độc tố có thể kích hoạt hoặc ức chế kênh ion Na cũng được đánh giá. PbTx-1 gây ra sự gia tăng nồng độ phụ thuộc và bão hòa trong hoạt động của luciferase. Mặc dù cần bổ sung thêm đặc tính của thử nghiệm này để đánh giá hiệu suất đối với các loài cá và các mạng lưới nhuyễn thể hai mảnh vỏ khác nhau, các sắc tố của tảo và các phân lớp khác của độc tố tảo, các thử nghiệm như được trình bày đã đáp ứng hoặc vượt quá sự nhạy cảm của các thử nghiệm sinh học hiện tại cho các độc tố trên tảo kích hoạt kênh ion natri.
Cổng điện áp của các kênh ion natri là các protein cần thiết của màng tế bào thần kinh. Một protein màng tế bào tinh khiết có thể được kết hợp vào một lớp kép lipid bằng cách hình thành một túi với sự hiện diện của nó, và quá trình này được gọi là "sự hoàn nguyên”. Một khi các phospholipid thích hợp cho phục hồi chức năng của các kênh natri đã được làm sáng tỏ, các kênh tái tạo có thể được sử dụng như một công cụ để xác định các liên kết đặc trưng của các độc tố tảo. Liên kết đặc trưng của PbTx-3 với các kênh natri trong não chuột sạch được tái tạo thành các túi phospholipid đã được làm rõ. Việc làm rõ liên kết đặc trưng của độc tố với kênh natri mở đường cho sự phát triển của một thử nghiệm chức năng rất đặc trưng cho sự hiện diện của các độc tố này trong mô sinh học (Trainer và cộng sự, 1995).
Phép thử liên kết với synaptosome
Thử nghiệm synaptosome là một thử nghiệm cạnh tranh liên kết trong đó độc tố NSP đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và/hoặc các dẫn xuất của nó cạnh tranh với NSP không được đánh dấu tại một số vị trí nhất định trên các thụ thể có sẵn trong các synaptosome của não chuột. Phần trăm giảm của liên kết NSP được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ tỷ lệ thuận với lượng độc tố không được đánh dấu hiện diện trong một mẫu không xác định (Poli và cộng sự, 1986). Cũng như trong trường hợp xét nghiệm miễn dịch (xem Chương 5. 2. 2), cả PbTx-2 và PbTx- 3 trục xuất 3H-PbTx-3 theo một phương thức tương đương. Tuy nhiên, PbTx-2 oxy hóa không thay thế 3HPbTx-3 như trong trường hợp các xét nghiệm miễn dịch (Baden và cộng sự, 1988).
Van Dolah và cộng sự (1994) đã phát triển một thử nghiệm liên kết synaptosome thông lượng cao cho brevetoxin bằng cách sử dụng công nghệ chỉ báo nhấp nháy microplate. Các thử nghiệm microplate có thể được hoàn tất trong vòng ba giờ, có giới hạn phát hiện nhỏ hơn 1 ng và có thể phân tích hàng chục mẫu cùng một lúc. Thử nghiệm đã được chứng minh là hữu ích cho việc đánh giá độc tính của tảo, tinh chế brevetoxins và phát hiện brevetoxins trong sản phẩm thủy sản.
202
Một thử nghiệm của AOAC theo phương pháp xác minh ngang hàng cho các thử nghiệm thụ cảm microplate của Van Dolah và cộng sự cho PbTx trong hàu đang được tiến hành (Quilliam, 1999).
Whitney và các cộng sự (1997) đã báo cáo các biểu hiện phức tạp xuất hiện trên các mô của động vật biển trong các thử nghiệm synaptosome não chuột. Các chất chiết xuất từ lợn biển, cá, rùa và các mô của trai cho thấy có chứa một số thành phần gây cản trở bằng cách cộng tác, ức chế không cạnh tranh liên kết đặc hiệu 3H-PbTx-3 và tăng cường liên kết không đặc hiệu với các synaptosme.
Whitney và các cộng sự (1997) đã phát triển một phương pháp khắc phục được những vấn đề này.
Phép thử trên lát mỏng của vùng đồi thị
Kerr và các cộng sự (1999) đã nghiên cứu các lát mỏng của vùng đồi thị ở chuột trong ống nghiệm như là một kỹ thuật nhanh chóng và đặc biệt để phát hiện các độc tố tảo biển STX, brevetoxin và DA trong mô nhuyễn thể hai mảnh vỏ và xác định các ký hiệu điện sinh học độc tố đặc trưng cho mỗi loài. Có thể kết luận rằng việc chuẩn bị lát mỏng của vùng đồi thị là hữu ích trong việc phát hiện và phân tích các độc tố sinh học biển trong mô nhuyễn thể hai mảnh vỏ bị nhiễm độc.