Vào tháng 11 năm 1995, tại Hà Lan đã có ít nhất 8 người bị trúng độc sau khi ăn vẹm (Mytilus edulis), nuôi tại vịnh Killary Harbour, Ai-len. Các triệu chứng biểu hiện tượng tự như các trường hợp trúng độc nhuyễn thể gây tiêu chảy (DSP), tuy nhiên nồng độ các độc tố thuộc nhóm DSP được tìm thấy rất thấp (McMahon và Silke, 1996; Satake và các cộng sự, 1998a) . Đồng thời trong các mẫu nước thu được tại thời điểm đó đã không phát hiện ra sự có mặt của nhóm sinh vật sản sinh ra độc tố DSP. Ngoài ra, khi tiến hành thử nghiệm trên chuột với dịch chiết từ mẫu vẹm nêu trên thì phát hiện ở chuột có dấu hiện mất cảm giác. Những triệu chứng nhiễm độc thần kinh này khác xa so với ngộ độc DSP thông thường (Satake và các cộng sự, 1998a). Về sau, các biểu hiện bệnh lý này được xác định là do azaspiracid (tên thường gọi là Killary Toxin-3 hoặc KT3) và sự trúng độc này đã được gọi tên là ngộ độc nhuyễn thể azaspiracid (AZP).
6.1 Cấu trúc hóa học và đặc tính
Satake và cộng sự (1998b) đã nghiên cứu cấu trúc của azaspiracid trên cơ sở vụ ngộ độc ở người do ăn vẹm chứa độc tố tại Ai-len. Kết quả phân tích dịch chiết của toàn bộ phần cơ thịt vẹm nhiễm độc cho thấy rằng azaspiracid có dạng tinh thể rắn vô định hình và không thể hiện cực đại hấp phụ nguồn UV ở bước sóng trên 210 nm. Ngoài azaspiracid (AZA), bốn đồng chất của nó, từ AZA 2 tới AZA 5, đã được tách và nghiên cứu về cấu trúc hóa học (xem hình 6.1). Ofuji và cộng sự (1999a) đã xác định được azaspiracid-2 (AZA-2) và azaspiracid-3 (AZA) và chứng minh rằng những thành phần này có bản chất lần lượt là 8- methylazaspiracid và 22-demethylazaspiracid. Ông và cộng sự cũng đã định dạng cấu trúc của hai đồng chất khác của azaspiracid tìm thấy trong vẹm là azaspiracid- 4 (AZA-4) và azaspiracid-5 (AZA-5) và chỉ ra rằng chúng có bản chất lần lượt là 3-hdroxy-22-demethylazaspiracid và 23-hydroxy-22-demethylazaspiracid (như vậy thành phần của AZA-3 tương tự cũng là sản phẩm của quá trình hydroxyl hóa). Hiện tại, chưa có dữ liệu thực nghiệm nào chứng minh được liệu có sự biến đổi về mặt cấu trúc của các độc tố này trong nhuyễn thể hay không và nếu có thì việc biến đổi như thế nào vẫn là một câu hỏi chưa có câu trả lời. Dựa trên kết quả nghiên cứu về sự thay đổi cấu trúc được thực hiện bởi quá trình hydroxyl hóa của hai nhóm độc tố là pectenotoxins và yesotoxins, người ta cho rằng AZA-4 và AZA-5 là sản phẩm chuyển hóa oxy hóa của AZA-3. Như vậy, AZA, AZA-2 và cả AZA-3 được xem là sản phẩm chính sinh ra bởi một loài sinh vật biển gây độc.
Satake và cộng sự (1998b) cũng chỉ ra rằng azaspiracid được xem là tác nhân gây độc chủ yếu. Kết quả nghiên cứu cho thấy, azaspiracids không giống những độc tố có chứa nitơ trong nhuyễn thể hoặc một số loài tảo độc (ví dụ như prorocentrolide, pinnatoxin, gymnodimine and spirolides) đã từng được nghiên cứu trước đây.
Azaspiracids (AZAs) có cấu trúc vòng xoắn khá độc đáo với cấu trúc lặp của chỉ một amin mà không phải là một nhóm các imine (nhóm chức tạo bởi nối đôi giữa
245
nitơ và cacbon) được tuần hoàn với nhau, đồng thời trong cấu trúc của chất này cũng thiếu các vòng lacto và cacbon (Satake và cộng sự, 1998b)
Vào năm 2001, Dounay and Forsyth đã tiến hành các nghiên cứu sinh tổng hợp đối với các azaspiracid trong phạm vi từ C5 tới C20 để xác định cấu trúc của từng đoạn riêng lẻ trong phân tử các azaspiracid này.
Satake và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, hàm lượng độc tố trong dịch chiết từ vẹm đã không giảm một cách đáng kể khi mà dịch chiết này được gia nhiệt ở 5oC trong 150 phút với dung dịch chiết là axit axetic 1N trong methanol hoặc dung dịch ammonium hydroxide, đồng thời cũng không có sự thay đổi đáng kể nào về độc tính của dung dịch trong suốt thời gian bảo quản. Như vậy, có thể nói các hợp chất AZAs là các thành phần tương đối ổn định.
Hình 6.1 Cấu trúc hóa học của azaspiracids 6.2 Các phương pháp phân tích
6.2.1 Giới thiệu chung
246
Một vấn đề khoa học đặt ra là sự hiện hữu đồng thời của OAs, PTXs và YTXs trong vẹm. Khả năng đồng tồn tại của AZA và các độc tố khác cũng là mối nguy đáng kể trong vẹm đánh bắt tại Na Uy (Yasumoto và Aune, tài liệu nội bộ của EU/SANCO, 2001).
Do đó, các phương pháp phân tích hóa học như sắc kí lỏng (LC) và sắc kí lỏng khối phổ (LC/MS) được khuyến cáo sử dụng để kiểm tra các độc tố này.
Trong các vụ bùng phát ngộ độc AZP đã xác định một số độc tố chưa định danh tồn tại trong vẹm ở nồng độ thấp (khoảng 12% độc tính tổng số). Những con chuột được tiêm chất độc lạ này đã có phản ứng tức thì ngay sau khi tiêm với các biểu hiện trước khi chết như kích động mạnh, tê liệt và các triệu chứng co giật tương tự sự trúng độc PSP. Bên cạnh những triệu chứng này ở chuột, điểm khác biệt giữa đặc tính của các độc tố lạ này với các độc tố AZP có thể xác định bằng phương pháp sắc kí (thường áp dụng đối với các độc tố không có axit moiety). Những con chuột được tiêm chất độc này sau đó đã chết trong vòng 30 phút. Ở những con chuột còn sống sót thì quá trình phục hồi diễn ra rất nhanh. Hiện tại, chưa có dữ liệu nào cho thấy liệu các độc tố chưa định danh này có đủ lớn tới mức làm sai lêch các kết quả nghiên cứu trong các phép thử sinh học trên chuột. (EU/SANCO, 2001)
6.2.2 Các phương pháp sinh học
Các nghiên cứu tiến hành trên cơ thể sống Phép thử sinh học trên chuột nhắt
Dịch chiết từ vẹm được tiêm vào phúc mạc chuột tương tự phép thử sinh học đã tiến hành trên chuột để kiểm chứng DSP. Kết quả cho thấy azaspiracids từ thịt vẹm sống có thể được chiết bằng acetone và khả năng hòa tan được tăng cường nhờ sự tồn tại của nước và chất béo có trong cơ thịt (EU / SANCO, 2001).
Kiểm chứng về phản ứng của azaspiracid được đặc trưng bởi sự ngứa rát và tiến triển tới tê liệt tương tự như các dấu hiệu điển hình của trúng độc DSP (Flanagan và cộng sự, 2000; Satake và cộng sự, 1998a). Chuột sau khi bị tiêm độc tố này đã chết trong thời gian nhanh nhất là 35 phút (nồng độ gây độc bằng sáu lần so với liều gây chết người) và muộn nhất là 30 giờ và 46 phút (EU/SANCO, 2001).
Thông thường, độc chất nhóm polyether tập trung ở tuyến tiêu hóa của các loài nhuyễn thể, nhưng azaspiracids là trường hợp ngoại lệ. Azaspiracid và các chất tương tự của nó, AZA2 và AZA3, được phân bố khắp các mô của nhuyễn thể. Quy trình chuẩn trong phép thử sinh học trên chuột (sử dụng duy nhất hepatopancreas để kiểm tra) có thể được áp dụng để xác định hàm lượng azaspiracid trong nhuyễn thể. Tuy nhiên, các quy trình thông thường này chỉ xác định được tối đa khoảng 40% tổng hàm lượng azaspiracid thực có trong mẫu, do đó trong nhiều trường hợp kết quả thu được là âm tính giả (Jameset và cộng sự, 2002a).
247
Phép thử sinh học trên chuột
Phép thử này được thực hiện dựa trên dấu hiệu tiêu chảy ở chuột. Các vật chủ (trong tình trang đói) được cho ăn với thịt nhuyễn thể nghi ngờ chứa độc chất (bằng cách trộn vào với thức ăn thông thường) để quan sát các dấu hiệu của bệnh tiêu chảy cũng như độ ổn định của phân và dấu hiệu bất dung nạp thức ăn trong vòng 16 giờ. Theo Hallegraeff và cộng sự (1995) cũng như Van Egmond và cộng sự (1993), phương pháp này có thể coi là phương pháp bán định lượng hiệu quả nhất. Cho tới nay, phép thử này vẫn được áp dụng rộng rãi ở Hà Lan và cũng là quy trình áp dụng chính thức trong các luật ở Châu Âu.
Kết luận chung
Ủy ban Châu Âu đã chấp nhận yêu cầu của các hiệp hội phân tích cần phải tích cực phát triển các phương pháp thay thế các thí nghiệm tiến hành trên động vật. Một hoạt động hậu thuẫn cho định hướng của Chương trình khung số 6 được đưa ra bởi Hội đồng tại phần 5: “Chất lượng thực phẩm và An toàn thực phẩm”
với mục tiêu phát triển các dụng cụ phân tích và phát hiện mối nguy liên quan tới thủy sản ở một số lưu vực biển, trong đó có cả mối nguy về ngộ độc Azaspiracid trong nhuyễn thể. Nếu được duyệt, chúng ta có thể hi vọng sẽ có nhiều tiến bộ trong phương pháp kiểm nghiệm Azaspiracid trong những năm tới đây.
Những nghiên cứu trong ống nghiệm
Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật có vú
Chiến lược phát triển các chẩn đoán thay thế trong việc phát hiện nhiễm độc ở nhuyễn thể được thúc đẩy dựa trên cơ sở các vấn đề khoa học, các mối quan tâm về mặt đạo đức và tài chính. Để thực hiện điều này, một phương pháp đang được phát triển dựa trên các phản ứng bệnh học của các tế bào động vật có vú được nuôi cấy với chất độc. Phản ứng đầu tiên của các tế bào này với các độc chất gốc axit okadaic là hội chứng "Round-up" và sự suy giảm hình thái đặc trưng của chúng trong vòng ba giờ và khoảng 90 phần trăm có thể sống sót cho đến 48 giờ.
Các mẫu dương tính với Azaspiracid cũng được thử nghiệm bằng phương pháp này, tuy nhiên trên các tế bào được nuôi cấy không thấy xuất hiện hiệu ứng
“round-up”. Thay vào đó, một xét nghiệm MTT cho thấy khả năng sống sót của các tế bào chỉ chiếm khoảng chưa tới 10% so với các mẫu kiểm soát sau thời gian 18 tới 24 giờ. Theo Flanagan và cộng sự (2000;2001), việc phát hiện đồng thời các độc tố nhóm axit okadaic và azaspiracid trong nhuyễn thể có thể thực hiện nhờ sự kết hợp giữa việc quan sát hình thái tế bào trong vòng 3 giờ và đo lường khả năng sống sót trong vòng 24 giờ.
6.2.3 Các phương pháp hóa học Phương pháp quang phổ
248
Phương pháp định lượng azaspiracid bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) đầu tiên được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu sự định phân ion được lựa chọn (SIM) (Ofuji và cộng sự, 1999b.), theo quy định mỗi ion đặc trưng cho một thành phần và sử dụng chất chuẩn ngoài. Việc kiểm tra độ tuyến tính đã được thực hiện ở dải nồng độ tương đối rộng (50 pg đến 100 ng). Mặc dù các dữ liệu tái hiện cho thấy kết quả dường như đúng nhưng nó không thể hiện rõ số lượng mẫu cần là bao nhiêu để hình thành nền tảng cho việc thực hiện các thử nghiệm phục hồi. Điều này là bởi vì mỗi ion được sử dụng để giám sát một thành phần mà không kiểm tra đặc tính của thành phần đó có thể liên quan tới tỉ lệ về cường độ ion. Nói tóm lại, cơ sở phương pháp luận của phương pháp này chưa đủ mạnh, do đó dấy lên những nghi ngờ về khả năng ứng dụng của nó trong thực tế.
James và cộng sự (2001) đã trình bày việc ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trong xác định AZAs. Vào năm 2000, Draisci và cộng sự cũng đã xây dựng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ vi phân (micro LC-MS-MS) dùng để xác định azaspiracid. Trong thực tế, nội dung của báo cáo tập trung chủ yếu vào việc xác định các azaspiracids, vì vậy phương pháp này được coi là phân tích định tính. Xét cho cùng mục đích ban đầu của phương pháp này là "... kiểm tra độ ổn định của phương pháp LC-MS và LC-MS-MS để xác định cụ thể azaspiracid trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ." Mức phát hiện thu được tương đối nhạy nhờ việc áp dụng phương pháp kiểm soát ion chọn lọc (SIM) với những ion có độ tương thích với các phân tử mang điện tích dương nêu trên. Độ nhạy cao (được định nghĩa trong khoảng giới hạn phát hiện thấp) cũng có thể đạt được nhờ áp dụng giải pháp sắc kí lỏng vi phân (micro-LC) (cột I.D. 1,0 mm) một cách hiệu quả khi mà Electrospray-MS là một đầu dò phụ thuộc nồng độ. Trong nghiên cứu này, phương pháp sử dụng là khối phổ cấu hình bộ ba tứ cực (tripleQ). Trong nghiên cứu về độc tố sinh học biển, hệ thống thiết bị này thường được sử dụng phổ biến hơn phương pháp khối phổ bẫy ion. Thông tin về cấu trúc của độc chất được thu thập bằng cách sử dụng năng suất tripleQ của hệ thống CID-MS-MS. Cụ thể là, các ion tương thích đầu tiên sẽ được sử dụng dưới dạng hình ảnh quét đầy đủ và sau đó thì sử dụng mô hình SRM. Kiểu hình SRM đã được tối ưu hóa và đưa ra kết quả dưới dạng kết quả định lượng. Hệ số tương quan cao được tìm thấy đối với độc chất có khoảng nồng độ thấp (từ 0,1 tới 1 àg/ml), trong khi đú giới hạn phỏt hiện của azaspiracid là 20 ng/g cơ thịt. Như vậy, phương pháp này cho phép xác định kết quả một cách cụ thể và đại diện. Tuy nhiên, tác giả đã chỉ ra rằng "phương pháp này khó có thể đạt được độ chính xác do thiếu các azaspiracid chuẩn cần thiết để làm các thí nghiệm kiểm chứng”.
Lehane và cộng sự (2002) đã công bố kết quả phát triển phương pháp LC- ESI-MS nhằm xác định ba độc tố phổ biến nhất trong nhóm AZA (AZA1, AZA2, AZA3), và các đồng chất có tính hydroxy hóa (AZA4, AZA5). Ông đã chứng minh rằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ cho kết quả nhạy hơn phương pháp sắc ký đơn khối phổ, điều này được giải thích là ".. do phương pháp sắc ký ghép
249
khối phổ có độ nhiễu nền thấp hơn nhiều so với phương pháp sắc ký đơn chứ không phải do sự suy giảm trong tín hiệu của chất phân tích." Quan trọng hơn là việc hoạt hóa trên dải băng thông rộng cho phép chúng giảm thời gian lưu trong việc xác định năm loại azaspiracids nói trên. Mặc dù tác giả đã cố gắng nghiên cứu giảm thời gian chuẩn bị mẫu tới mức tối thiểu nhưng tổng thời gian chuẩn bị mẫu vẫn được coi là công đoạn chiếm nhiều thời gian nhất trong tổng thời gian phân tích.
Ngoài các bài báo được công bố nêu trên, nhóm nghiên cứu này còn triển khai phép so sánh giữa các phương pháp xác định azaspiracids bằng cách chiết pha rắn thử nghiệm trên nhuyễn thể bằng phương pháp LC-ESI-MS của Lehane (Moroney và cộng sự, 2002.). Dữ liệu về khả năng tái tạo và phục hồi cho kết quả khá tốt với cột diol SPE và với cả hai loại cột SPE C18. Các nhà nghiên cứu cũng chỉ ra rằng: "... các phương pháp SPE hiệu quả cho quá trình chuẩn bị mẫu trên đây nên tiếp tục được cải thiện hiệu quả hơn nữa trong nghiên cứu các phương pháp phân tích thay thế để xác định chất độc AZP trong nhuyễn thể". Điều này cũng phù hợp với công bố trước đó của họ "quá trình chuẩn bị mẫu để xác định phycotoxins trong nhuyễn thể có thể bị ảnh hưởng do những biến động về hàm lượng độc tố"
Nhóm nghiên cứu này cũng đã công bố kết quả nghiên cứu phát triển phương pháp ở một tạp chí khác (Furey và cộng sự, 2002) "với mục tiêu ban đầu là xây dựng một phương pháp có thể sử dụng linh hoạt cho các hàm lượng azaspiracids khác nhau ". Đặc biệt là những nghiên cứu sử dụng hệ tuyến tính mở rộng của họ trên mẫu thử là dịch chiết từ nhuyễn thể được đề cập trong hơn hai thập kỷ như sau: kết quả đạt được là khá tốt cho một khoảng nồng độ nhất định.
Dữ liệu này cho thấy các phương pháp nêu trên có thể áp dụng khi thay đổi hàm lượng độc tố trong mẫu. Nhóm nghiên cứu cũng đã công bố một ứng dụng của phương pháp được đề cập trên đây (James và cộng sự, 2002a; 2002b). Báo cáo này cho kết quả về quang phổ của AZA1 và AZA3 thu được từ phương pháp sắc ký khối phổ LC-MS trong cả hai trường hợp đối với chất chuẩn và chất phân tích trong các mẫu dịch chiết từ vẹm.
6.3. Các sinh vật nguồn và môi trường sống
Vào năm 1996, tại Ai-len đã có nhiều trường hợp ngộ độc AZP được phát hiện. Tháng 11 năm 1997, khu vực đảo Avianmore của Donegal, phía Tây Bắc Ai- len nhiều trường hợp nhiễm bệnh xảy ra liên tiếp và gây ra hiện tượng tái nhiễm ở người, đồng thời còn xảy ra ở các nước châu Âu khác (chủ yếu là do vẹm được đánh bắt từ Ai-len). Nguồn gốc chủ yếu của độc chất azaspiracids được cho là từ một loại tảo dựa trên kết quả kiểm chứng về cấu trúc dạng polyete có tính oxy hóa cao và sự xuất hiện theo mùa của độc chất này. Tuy nhiên, khi kiểm tra các mẫu nước thu thập tại thời điểm diễn ra ngộ độc lại không phát hiện loài thực vật phù du nào có chứa độc tố này (James và cộng sự, 2000b; Satake và cộng sự, 1998b).