4. Ngộ độc nhuyễn thể gây mất trí nhớ (ASP)
4.2.1 Các phép thử sinh học
143
Các phép thử trong cơ thể Phép thử sinh học trên chuột
Phép thử sinh học trên chuột của AOAC cho các độc tố PSP (AOAC, 1990) cũng có thể phát hiện DA ở nồng độ khoảng 40 mg/g mô. Phép thử sinh học trên chuột được thực hiện bằng cách tiêm khoảng 1ml chất chiết xuất dạng dung dịch có tính acid của mô (lấy từ toàn bộ cơ thể con vật hoặc từ một số cơ quan được lựa chọn) vào phúc mạc của chuột. Thời gian tính từ khi bắt đầu tiêm cho đến khi chuột bị chết đã được ghi nhận (thường là dưới 15 phút). Phương pháp này đã được sử dụng khi độc tố ASP lần đầu tiên được xác định trong dịch chiết của nhuyễn thể ở Canada. Các dấu hiệu đầu tiên của độc tính kết hợp với hội chứng ASP đã được biểu hiện trong quá trình thử nghiệm sinh học trên chuột theo phương pháp AOAC cho độc tố PSP. Các kỹ thuật viên giàu kinh nghiệm trong phân tích sinh học đã lưu ý rằng các triệu chứng bất thường của ngộ độc ASP được phân biệt với các triệu chứng thường gặp của ngộ độc PSP là khi bị ngộ độc ASP thì thường dẫn đến tử vong. Sự thành công của phương pháp này trong vụ ngộ độc ASP đầu tiên một phần là nhờ vào lượng độc tố hiện diện ở mức cao trong nhuyễn thể ở phía Đông đảo Hoàng tử Edward. Dấu hiệu điển hình thể hiện sự hiện diện của DA là hội chứng cào gãi vai bằng chân sau rất đặc trưng, tiếp theo đó là các cơn co giật. Thời gian quan sát thường kéo dài từ 15 phút đến bốn giờ.
Mặc dù phương pháp tách chiết theo AOAC có thể thu hồi một lượng đáng kể DA nhưng giới hạn phát hiện của phương pháp thử nghiệm sinh học theo AOAC lại không đủ nhỏ để có thể sử dụng một cách đáng tin cậy cho mục đích kiểm soát để định lượng loại độc tố này. Ở Canada đã xây dựng được giá trị giới hạn của độc tố này cho loài vẹm và sau đó giá trị này cũng được thông qua ở hầu hết các nước khác, cụ thể là những nước này đã đặt ra giới hạn cho ASP là 20 mgDA/g mô. Đối với việc phát hiện các độc tố ASP thông thường, phương pháp thử nghiệm sinh học theo AOAC đã được thay thế bằng phương pháp LC sử dụng diode-array/UV hoặc phương pháp thử định tính bằng cách dùng thuốc thử flo, các phương pháp này đã được chứng minh là có thiết bị nhạy cảm hơn và cho kết quả đáng tin cậy hơn (Fernandez và Cembella, 1995).
Tasker và cộng sự (1991) đã phát triển một thang đánh giá hành vi giả định từ số không (bình thường) đến bảy (chết), và các tác giả này đã tuyên bố rằng thang đánh giá này biểu thị các triệu chứng rất thường gặp ở những con chuột được tiêm độc tố vào phúc mạc. Các tác giả này tiếp tục khẳng định rằng các thang đánh giá có thể được sử dụng để lượng tử hóa một cách đáng tin cậy các nồng độ DA thấp như 20 mg/con chuột (~ 0,8 mg/kg bw).
Các phép thử trong ống nghiệm.
Các thử nghiệm liên kết với thụ quan
144
Một thử nghiệm microplate cạnh tranh liên kết thụ quan cho DA bằng cách sử dụng synaptosomes não ếch (Rana pipiens) đã được phát triển. Các phân tích DA dựa trên sự cạnh tranh liên kết với axit kainic [3H] đánh dấu phóng xạ nhằm hoạt hóa các thụ quan kainate/quisqualate glutamate. Phương pháp này tỏ ra nhạy cảm (IC50 0,89nM ~ 0,3 mg) và cho thấy triển vọng đây là một phương pháp phân tích tự động nhanh DA ở sản phẩm thủy sản bị ô nhiễm và các mẫu thực vật phù du độc. Các kết quả sơ bộ với chất chiết xuất từ Pseudo-nitzschia pungens f.
multiseries đã chỉ ra mối tương quan có chất lượng tốt với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng fluorenylmethoxycarbonyl (Van Dolah và cộng sự, 1994). Năm 1995, phương pháp này đã được báo cáo là vẫn đang còn trong giai đoạn sau của thử nghiệm dược học (Wright và Quilliam, 1995). Năm 1997, Van Dolah và các cộng sự báo cáo đã phát triển một thử nghiệm liên kết thụ quan trong đó thay thế bộ não ếch bằng một thụ quan glutamate của chuột nhân bản vô tính GLUR6 để có thể loại trừ động vật ra khỏi các cuộc thử nghiệm. Giới hạn phát hiện và chọn lọc của phép thử đã được tối ưu hóa thông qua các bước tiền xử lý glutamate decarboxylase để loại bỏ sự can thiệp có thể có do nồng độ glutamate nội sinh cao ở động vật có vỏ. Các thử nghiệm liên kết thụ quan của Van Dolah và cộng sự (1997) thích hợp cho phân tích DA trong các chất chiết xuất từ nước biển từ tảo và phân tích DA trong nhuyễn thể.
Chuẩn bị lát mỏng vùng đồi thị.
Hiệu quả của việc chuẩn bị các lát mỏng của vùng đồi thị trong ống nghiệm đã được kiểm tra và cho thấy đây là một kỹ thuật nhanh chóng và đặc biệt để phát hiện DA. Phản ứng ngoại bào thần kinh được ghi nhận từ vùng CA1 của các lát cắt vùng đồi thị của chuột trưởng thành Sprague-Dawley đã được để ngập hoàn toàn, sử dụng các tiêu chuẩn tham chiếu trong phạm vi 50-1000 nM. DA tạo ra một sự gia tăng nhanh chóng và có thể hồi phục trong biên độ tăng đột biến lượng orthodromic và giảm trong môi trường EPSP (extra-cellular potential from stratum radiatum). Kết quả của thí nghiệm này chỉ ra rằng việc chuẩn bị các lát cắt vùng đồi thị là một công cụ hữu hiệu để phát hiện DA (Kerr và cộng sự, 1999, Saba và cộng sự, 1997).
4.2.2 Phép thử sinh hóa.
Các phép thử miễn dịch học
Phương pháp ELISA dùng để phát hiện sự hiện diện của DA trong huyết thanh và nước tiểu của động vật có vú được phát triển bằng cách sử dụng các kháng thể đa dòng được sản sinh trên thỏ. Phương pháp có hiệu quả trong việc xác định nồng độ DA trong nước tiểu chuột, với một giới hạn định lượng mức dưới là 40 ng/ml. Nồng độ DA ở huyết tương chuột và khỉ không thể được xác định chính xác bằng cách sử dụng huyết thanh miễn dịch này trong phương pháp ELISA. Hệ thống phát hiện này đã không được coi là đối tượng để thử nghiệm sâu rộng hay để sử dụng như là một kỹ thuật thường xuyên (Cembella và cộng sự, 1995, Smith
145
và Kitts, 1994). Phương pháp trên có liên quan đến nhiều bước và không có giới hạn phát hiện mong muốn. Ngoài ra, phương pháp phụ thuộc vào sự bất hoạt vật lý của DA trên microplate thông qua một protein vận chuyển. Hiện nay, CovaLink NH microplates ® đã phát triển một dự án trong đó nhóm amin thứ cấp được dùng trong ELISA làm khớp nối peptide, steroid, oligonucleotides, và ADN với các bề mặt microplate một cách trực tiếp và hóa học. Việc sử dụng các microplates CovaLink để đơn giản hóa và cải tiến phương pháp ELISA, đã dẫn đến việc tạo ra hai phiên bản khác nhau của phương pháp ELISA, một là dựa trên tính chất vật lý của DA, hai là dựa trên khả năng cố định hóa học của DA (Osada và cộng sự, 1995).
Các phương pháp ELISA để xác định DA trong dịch cơ thể của người và các chất chiết xuất từ vẹm đã được phát triển bởi Smith và Kitts trong hai năm (1994 và 1995). Các xét nghiệm sử dụng một loại huyết thanh miễn dịch polyclonal được tạo ra ở chuột để kháng lại liên hợp ovalbumin-DA. Thử nghiệm được sử dụng để định lượng nồng độ DA trong các dịch lỏng trong cơ thể người đã tăng đột biến với domoate tinh khiết. Các giới hạn định lượng thấp hơn 0,2 mg/ml trong nước tiểu, 0,25 mg/ml trong huyết tương và 10 mg/ml trong sữa. Giới hạn định lượng tương đối cao trong sữa có thể là do hàm lượng chất béo cao của sữa. Các tác giả cho rằng các mẫu sữa của con người có thể cần được tách chiết trước khi phân tích (Smith và Kitts, 1994). Các thí nghiệm xác định lượng còn lại trong cả hai dịch chiết của mô trai trong dung dịch nước và dung dịch acid đã chứng minh rằng nồng độ DA có thể được đo chính xác tương ứng khoảng 8% giá trị thực tế. Giới hạn phỏt hiện là 0,25 àg/ml chất chiết xuất. Giỏ trị này đại diện cho 0,5 mg DA/g mô vẹm khi các chiết xuất acid được phân tích (theo AOAC) (Smith và Kitts, 1995). Khi so sánh trực tiếp phương pháp xác định DA bằng LC và ELISA thấy có sự tương quan (r = 0,96), mặc dù các phương pháp ELISA cho kết quả cao hơn ở hầu hết các mẫu. Điều này là do một phần DA bị mất mát trong chiết xuất pha rắn trước khi tiến hành phương pháp HPLC hoặc có thể là do sự hiện diện của các DA đồng phân. Đồng phân DA không đồng nhất với DA thì sẽ không được xác định trong các phân tích LC thông thường. Tuy nhiên, phương pháp ELISA có thể xác định DA tổng số bao gồm một diastereoisomer và ít nhất hai đồng phân cis-trans (Smith và Kitts, 1995).
Garthwaite và cộng sự (1998) sử dụng các kháng thể được nuôi cấy trong cừu để chống lại các tiếp hợp, liên kết thông qua các nhóm amin thứ cấp của DA, cùng với việc kích hoạt các ester có nguồn gốc từ hợp chất của DA như là tấm bảo vệ, để phát triển một phương pháp ELISA cạnh tranh gián tiếp cho nhuyễn thể và nước biển. Phương pháp ELISA có giới hạn phát hiện dưới 0,1 ng/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,15 ng/ml và phạm vi làm việc là 0,15-15 DA ng/ml. LOQ thì tương đương với 38 àg DA/kg cơ thịt nhuyễn thể, ớt hơn 500 lần so với giới hạn quy định của cơ thịt là 20 mg/kg. Phương pháp ELISA này cũng cho thấy đây là phương pháp thích hợp để phân tích DA trong các loài tảo nuôi và nước biển được
146
thu thập từ môi trường ở New Zealand, và do đó có tiềm năng để đưa ra cảnh báo sớm về sự nở hoa của tảo. Các hợp chất tương tự trong nước biển, chẳng hạn như axit kanaic, không làm ảnh hưởng đến phương pháp phân tích này.
Phương pháp ELISA được phát triển bởi Garthwaite và cộng sự (1998) đã được thương mại hóa bởi Biosense ®, được sản xuất dưới dạng một bộ kit, và chúng được dự định sử dụng trong giám sát thường xuyên hàm lượng DA trong các động vật thân mềm nuôi để kiểm tra xem có tuân thủ các giới hạn quy định hay không. Theo các nhà sản xuất thì phương pháp này cũng được áp dụng để định lượng DA trong các thành phần khác (xem www.biosense.com “Direct cELISA ASP assay” 2003). So với phương pháp ban đầu được thực hiện năm 1998, LOQ của bộ kit đó được giảm xuống 10 àg/kg nhuyễn thể. Việc phờ chuẩn tớnh hợp lệ của phương pháp ELISA ® Biosense đang được xem xét tại thời điểm viết bài này, nhưng một sự phê chuẩn sơ bộ giữa các phòng thí nghiệm có thẩm quyền ở Scotland, Chile và New Zealand cho thấy những bước đi tích cực đang được thực hiện (Kleivdal năm 2002).
Trong khi đó, các kháng thể được phát triển bởi Garthwaite là kháng thể đa dòng tự nhiên, Kawatsu và các cộng sự (1999) đã sản xuất được kháng thể đơn dòng chống lại DA và áp dụng chúng trong một phép thử miễn dịch cạnh tranh gián tiếp. Phạm vi xác định định lượng axit domoic và LOQ trong nhuyễn thể đã được ước tính là 0,15-10 DA ng / ml và tương ứng <40 ng DA / g, do đó khá tương đồng với các đặc tính được mô tả theo phương pháp ELISA của Garthwaite và các cộng sự (1998). Các tác giả báo cáo sự thu hồi của DA là 103% (C.V. 4,5
%) đối với DA thêm vào các chiết xuất từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ có nồng độ độc tố 0,02-0,2 ng/ml. Nhóm nghiên cứu tương tự cũng đã sử dụng các phối tử đơn dòng trong sắc ký ái lực miễn dịch, kết hợp với sắc ký lỏng (LC), đã sử dụng thành công để xác nhận sự hiện diện của DA trong các mẫu vẹm xanh thương phẩm (Mytilus edulis) (Kawatsu và cộng sự, 2000). Garthwaite và các cộng sự (2001) đã phát triển một nhóm phương pháp ELISA cho các độc tố ASP, NSP, PSP và DSP bao gồm yessotoxin như một hệ thống sàng lọc cho các mẫu nhuyễn thể bị ô nhiễm. Hệ thống sẽ phát hiện các mẫu nhuyễn thể bị nghi ngờ. Sau đó các mẫu bị nghi ngờ sẽ được phân tích bằng các phương pháp đã được phê duyệt bởi các cơ quan kiểm định quốc tế. Chiết xuất rượu cho khả năng thu hồi tốt với tất cả các nhóm độc tố.
Một kháng thể dựa trên cách tiếp cận mới hơn là việc sử dụng các cảm biến sinh học. Traynor và cộng sự (2002) mô tả đã phát hiện dư lượng DA trong nhuyễn thể với một cảm biến sinh học miễn dịch. Trong ứng dụng này DA liên kết với bề mặt cảm biến và sử dụng để tạo thành kháng thể đa dòng làm tăng mối liên hợp DA HAS. Các tác giả báo cáo thử nghiệm đã cho thấy đây là phương pháp phù hợp để phân tích nhanh chóng sò, trai, hàu và điệp. Giới hạn phát hiện là 0,8 mg/g, và một thử nghiệm nội bộ C. V. 8% đã được xác định tại liều lượng 20 mg/g, giới hạn hiện hành được pháp luật cho phép cho toàn bộ cơ thể. Tại thời
147
điểm viết bài này một sự so sánh quy mô lớn với phương pháp sắc ký lỏng đang được tiến hành. Công nghệ cảm biến sinh học được dự kiến sẽ trở thành một ứng dụng rộng rãi hơn trong việc xác định ASP trong tương lai gần.
4.2.3 Các thử nghiệm hóa học Sắc ký bản mỏng.
DA có thể được xác định bằng sắc ký bản mỏng như là một vết tắt tia UV yếu bị nhuộm màu vàng sau khi được phun dung dịch 1% ninhydrin (Quilliam và cộng sự, 1998). Các acid amin thông thường có mặt trong các chiết xuất thô có thể gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích và vì vậy cần được tách ra khỏi DA. Điều này có thể được thực hiện cho các mẫu sinh vật phù du bởi TLC hai chiều. Chiết xuất thô của các mô nhuyễn thể có thể không được phân tích trực tiếp vì chúng quá phức tạp. Một quy trình làm sạch (trao đổi anion mạnh trong chiết xuất pha rắn - strong anion change solid phase extraction [SAX-SPE] với những thay đổi nhỏ) tạo ra các mảnh vỡ nhỏ có thể được sử dụng trực tiếp hoặc tập trung trong chân không trước khi gắn vào một tấm gel silica. Chỉ TLC một chiều là cần thiết khi làm sạch và hầu như tất cả các axit amin gây ảnh hưởng đã được loại bỏ.
Phương phỏp này cho giới hạn phỏt hiện đối với DA là khoảng 0.5àg và điều đú cho phép phát hiện DA trong các mô của nhuyễn thể hai mảnh vỏ là khoảng 10 àg/g. Và cũng cú thể phỏt hiện DA trờn tấm TLC khi sử dụng một số thuốc thử phun khác. Ví dụ, sau khi phun một tấm TLC với vanillin, đầu tiên sẽ tạo thành màu vàng với các dạng acid của domoic (hoặc kainic) và sau đó sẽ chuyển sang màu hồng (Wright và Quilliam, 1995).
Quilliam và các cộng sự (1998) tiếp tục nghiên cứu TLC như là một kỹ thuật tách trong phương pháp xác định DA, sau khi tách chiết với methanol dạng dung dịch và tiếp sau đó là làm sạch bởi SAX-SPE. Ông áp dụng thành công phương pháp trên với sò điệp, trai móng tay và các mẫu cá cơm bị nhiễm độc DA, và đưa ra kết luận là có thể chứng minh phương pháp này có thể áp dụng thành công để sàng lọc thường quy các mô của nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong những phòng thí nghiệm không được trang bị hệ thống LC. Nó cũng là một phương pháp hóa học hữu ích để xác nhận DA trong các mẫu xét nghiệm dương tính bằng các phương pháp thử nghiệm ví dụ như thử nghiệm miễn dịch.
Phân tích axit amin.
Các dịch chiết từ dung dịch thô của sinh vật phù du có thể được phân tích trực tiếp bởi một hệ thống phân tích axit amin. Các dung dịch đệm và cột trao đổi ion thường được sử dụng cho việc phân tích thủy phân protein, DA tách rửa gần methionine. Đo độ hấp thụ ở 440 nm cho phép phát hiện các axit amin với các nhóm amin chính, trong khi hấp thụ ở 570 nm có chọn lọc phát hiện các axit amin như proline và DA. Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với DA vào khoảng 1àg/ml, khi tiờm khoảng 50 ml dịch chiết vào cột. Mặc dự giới hạn phỏt