2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT Chiết là phương pháp chuyển một chất ở trạng thái hòa tan hay huyền phù từ pha lỏng (hoặc rắn) này sang pha lỏng khác. Cơ sở vật lí của phương pháp này là dựa vào định luật phân bố Nernst. Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi thực vật. Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng [3].
Nguyên liệu mẫu thực vật được chiết với EtOH 90% ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết EtOH 90% được phân bố giữa H2O và các dung môi hữu cơ khác nhau n- hexan, etyl axetat, n-butanol nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần.
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ PHÂN TÁCH 2.2.1. Phương pháp sắc ký
Sắc ký (Chromatography) là phương pháp phân tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - giải hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký [3].
Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Tính chất hấp phụ của hệ sắc ký lớp mỏng (sắc ký bản mỏng, TLC, SKLM), đặc trưng bằng độ linh động Rf : Rf được xác định bằng phương trình:
Rf = a b
a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm) b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong các ngành hoá học, sinh học, hoá dược với nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ (thường từ 1 đến 100 x 10ˉ6 g), tốc độ phân tích nhanh, dễ thực hiện. Phương pháp TLC với chất hấp phụ silica gel được dùng để phân tích định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất
cũng như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký cột để kiểm soát điều kiện phân tách.
Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi trên pha tĩnh theo cơ chế hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất. Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén để dung môi rửa giải đi qua cột nhanh hơn. Cột sắc ký là những ống thủy tinh đường kính d = 0,5-5 cm và có độ dài l = 20-100 cm nạp đầy chất hấp phụ và pha động. Pha tĩnh rắn thường dùng là: silica gel, nhôm oxit, chất hấp phụ biến tính.
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc (a) phương pháp sắc ký cột và (b) sắc ký lớp mỏng 2.2.2. Phương pháp kết tinh lại
Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn. Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn.
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU CƠ Hiện nay, các phương pháp phổ là công cụ hiện đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Các phương pháp phổ được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất trong luận án bao gồm: phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân [10], [11].
2.3.1. Phổ khối lượng (MS)
Mỗi hợp chất hữu cơ có phân tử lượng xác định, khi dùng năng lượng bẻ gẫy phân tử sẽ cho phổ khối là tập hợp nhiều mảnh có tỷ số khối m/z xác định đặc trưng cho các hợp chất hữu cơ. Vì vậy, phổ khối là một trong những kỹ thuật phân tích cấu trúc và sử dụng để định tính mang tính khẳng định. Có thể so sánh phổ khối của hợp chất hữu cơ với phổ chuẩn trong thư viện hoặc đo song song với 1 mẫu chuẩn.
Phổ khối sử dụng kỹ thuật ion hóa và bẻ gãy phân tử bằng va chạm điện tử (EI-MS) hoặc bằng phun điện tử (ESI-MS) kết hợp đo thời gian bay qua tứ cực Quadrupole/Time of Flight (Q/TOF).
Kết hợp sắc ký lỏng với detector khối phổ (LC-MS) cho phép phân tích định tính nhiều hợp chất hữu cơ một cách thuận lợi. Sử dụng kỹ thuật phun điện tử (ESI) hoặc ion hóa bằng hóa học ở áp suất thường (APCI). Cũng thường được sử dụng phân tích định tính nhiều hợp chất tự nhiên. Thời gian lưu trên sắc ký đồ và các mảnh khối đặc trưng trên phổ đồ là đặc trưng cho mỗi chất. Kỹ thuật có độ nhạy và đặc hiệu cao.
2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phương pháp phổ NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử bằng sự tương tác của bức xạ điện từ tần số radio với tập hợp hạt nhân được đặt trong từ trường mạnh. Các hạt nhân này là một phần nguyên tử và các nguyên tử lại được tập hợp lại thành phân tử. Do đó phổ NMR là phương pháp hữu hiệu có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử.
Phổ cộng hưởng từ proton 1H-NMR (500 MHz) và phổ cộng hưởng từ cacbon
13C-NMR (125 MHz), DEPT 90, DEPT 135 cho biết số nguyên tử hidro và số nguyên tử cacbon (CH, CH2, CH3 và C)... Các phổ 2 chiều: phổ COSY, HSQC, HMBC... cho biết các cấu trúc không gian, dị tố...Từ các thông tin cộng hưởng từ, phân tích bằng nhiều kỹ thuật, kết hợp với các phương pháp mô phỏng (phần mềm), có thể dựng lại cấu trúc khung phân tử hữu cơ một cách chính xác.
Ngoài hai phương pháp trên, luận án còn sử dụng phương pháp xác định năng suất quay cực, điểm nóng chảy để dự đoán cấu trúc của các chất quen thuộc đã được
công bố. Mỗi một chất thường có năng suất quay cực và điểm chảy xác định, do đó 2 chỉ tiêu này thường được sử dụng để định tính. Ngoài ra, năng suất quay cực và điểm chảy cũng cho biết độ tinh khiết của hợp chất hữu cơ. Điểm chảy càng gọn và càng gần với giá trị ấn định, hợp chất càng tinh khiết.
2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.4.1. Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro
Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính trên tế bào dựa vào cơ chế ức chế tăng sinh tế bào trên hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống sót còn lại sau khi được xử lý với các mẫu thử. Enzym này biến đổi MTT [3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromide] có màu vàng nhạt thành formazan có màu vàng đậm, cơ chế phát hiện dựa trên sự đo màu ở bước sóng λ= 550 nm. Kết quả đánh giá tác dụng gây độc tế bào của các mẫu thử dựa trên thang điểm đánh giá của Viện nghiên cứu ung thư Quốc Gia Mỹ, chất thử được xem là có tác dụng gây độc tế bào, khi giá trị nồng độ gây chết 50% tế bào ung thư (đối với cao chiết thô từ dược liệu IC50 < 20 g/mL; chất tinh khiết IC50 <10 g/mL) [108].
2.4.2. Thử tác dụng chống oxy hóa
Phương pháp quét gốc DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thụ tại 517 nm. Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [27], [38].
Phương pháp định lượng ABTS•+: Cation 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonic acid (ABTS•+) là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS•+, các chất chống oxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-
tetramethylchroman-2-carboxylic acid). Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS•+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối [107].
Khả năng chống oxy hóa của một mẫu thử được đánh giá bằng giá trị IC50
(nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do), mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. Hoặc thông qua giá trị EC50 (nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể loại bỏ 50% gốc tự do)
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis, Excel và phần mềm thống kê GraphPad Prism 6.0 phù hợp tùy theo mỗi phép thử để có kết quả chính xác, đáng tin cậy.