4.5. CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP
4.5.1. Các hợp chất được phân lập từ thân rễ cây thồm lồm gai
Từ các phần chiết thân rễ cây thồm lồm gai đã phân lập và xác định cấu trúc 24 hợp chất bao gồm: 2 sterol là β-sitosterol (1T), daucosterol (9T), 1 polyhydroxynaphthalen là musizin (2T), 1 triterpenoid là 24(R/S)-cycloart-25- en-3β,24-diol (3T), 1 sphingolipid là 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2- [(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1,3,4-triol (4T), 1 terpenylcoumarin là 6-geranyl-7-hydroxy-8-methoxy-coumarin (5T), 5 tannin là 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (6T), 3,3',4-trimethoxy 4'-O--L- rhamnopyranosid ellagic acid (11T), acid chlorogenic (13T), (-)-epicatechin (16T), (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (19T), 1 anthraquinon là physcion (7T), isocoumarin là 4-hydroxymellein (8T), 1 đường là maltose (17T), 7 flavonoid và dẫn xuất là quercetin (10T), myricetin (12T), 4',5,7-trihydroxy-3',5'- dimethoxyflavone (14T), myricetin-3-α-L-rhamnosid (15T), quercetin-3-O-β-D- glucuronid (18T), quercetin 3-O-β-D-glucopyranosid (20T), kaempferol-3-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (22T), 1 imidazol là acid N-[(4R)- 2,5-dioxo-4-imidazolidinyl]-carbamic (21T), 1 phenyl propanoid đơn giản là 3- diferuloyl O-Z-β-D-fructofuranosyl (1→2)-α-D-glucopyranosid (23T), 1 lignan là lyonisid (24T).
β-Sitosterol (1T)
HO
17 18 19
20 22
5
24 26
27 28
29
3
Hợp chất 1T được phân lập từ phân đoạn TLH4. Dựa vào các tính chất vật lý (đnc, màu sắc, dạng tinh thể) và kết hợp sắc ký đối chứng với β-sitosterol chuẩn cho phép kết luận 1T là β-sitosterol.
Musizin (2T)
Hợp chất 2T được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, có nhiệt độ nóng chảy 162-163°C. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất 2T cho 13 tín hiệu xác định gồm 4 CH, 2 CH3, 7 C. Trong số này, một tín hiệu cacbon chuyển dịch về trường thấp đặc trưng cho nhóm cacbonyl ở δC 204,3 (COCH3); 10 tín hiệu cacbon δC 153,9 (C-1) 133,0 (C-2), 136,3 (C-3), 118,7 (C-4), 119,1 (C-5), 128,1 (C-6), 108,4 (C-7), 152,8 (C-8), 123,0 (C-9), 112,6 (C-10) thuộc về hai vòng thơm. Ở vùng trường mạnh hơn có hai tín hiệu của cacbon metyl ở δC 19,7 (CH3), 32,1 (COCH3).
Trên phổ 1H-NMR, 4 tín hiệu proton δH 7,28 (1H, t , J = 7,5; 8,0 Hz, H-6), 7,20 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 7,08 (1H, s, H-4), 6,77 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-7) đặc trưng cho các proton trong vòng thơm; tín hiệu proton ở δH 2,54 (3H, s) đặc trưng cho nhóm metyl liên kết với nhóm cacbonyl (COCH3) và một tín hiệu proton metyl khác ở δH 2,25 (3H, s). Kết hợp các tín hiệu phổ proton và phổ cacbon cho ta nhận diện ban đầu về kiểu khung naphtalen trong công thức cấu tạo của 2T. Phân tích kỹ hằng số tương tác J = 7,5; 8,0 Hz của 3 tín hiệu proton ở δH 7,20, 7,28, 6,77 cho thấy chúng phải thuộc về cùng một vòng benzen và phải nằm ở vị trí octo với nhau (H-5, H-6, H-7). Một tín hiệu proton singlet khác thuộc về vòng benzen còn lại δH
7,08 (1H, s, H-4).
OH
OH O
1 2 4 3 5 6 7
8 9
10
Từ việc phân tích các dữ kiện phổ trên kết hợp với tham khảo tài liệu [128]
cho phép kết luận hợp chất 2T là một dẫn xuất của naphtalen có tên gọi 2-acetyl-3- methyl-1,8-naphthalenediol hay musizin. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây thồm lồm gai.
24(R/S)-cycloart-25-en-3β,24-diol (3T)
Phổ 1H-NMR của 3T cho tín hiệu singlet của các proton thuộc về sáu nhóm metyl thế ba lần ở δH 1,73 (3H, s, H-18), 0,97 (6H, s, H-21 & H-28), 0,87 (3H, s, H- 27), 0,80 (3H, s, H-29), 0,89 (3H, s, H-30); hai proton của vòng cyclopropane cho
tín hiệu doublet rất đặc trưng tại δH 0,33 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-19a), 0,55 (1H,d, J = 4,0 Hz, H-19b). Một proton metin cộng hưởng chuyển dịch về trường thấp hơn (δH 4,10) chứng tỏ nó phải liên kết với cacbon gần dị tố (ở đây là nguyên tử oxi của nhóm hydroxyl). Tín hiệu proton của một nối đôi đầu mạch δH 4,83 và 4,93. Thêm vào đó, sự có mặt của proton ở δH 3,28 (1H, m, H-3) chứng tỏ rằng 3T là một triterpene có khung cycloartane.
HO
OH
1 3
5 9 8 10
13 14
17 18 19
20 21
22 23
24 25
26 27
28 29
30
Kết hợp phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy 3T gồm 6 CH3, 11 CH2, 6 CH và 6 C. Sự xuất hiện của nối đôi đầu mạch (>C=CH2) cũng được khẳng định bởi các tín hiệu tại δC 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25), 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) (C-26) tương ứng với hai tín hiệu proton ở δ 4,83 và 4,93. Điều đặc biệt ở đây là sự xuất hiện của các pic cacbon theo cặp đôi của C-25 và C-26 ở δC 147,5 (24S) (C- 25), 147,8 (24R) (C-25) và 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) chứng tỏ rằng hợp chất 3T là một hỗn hợp epimer R/S gây ra bởi nguyên tử cacbon bất đối ở C-24.
Từ việc phân tích trên, kết hợp với so sánh các dữ kiện phổ đã công bố [82]
cho phép kết luận về cấu trúc của 3T là 24(R/S)-cycloart-25-en-3β,24-diol. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây thồm lồm gai.
1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'- enoylamino]-8-nonacosene-1, 3, 4-triol (4T)
Hợp chất 4T phân lập được dưới dạng chất rắn màu trắng.
Phân tích các dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của chất 4T cho thấy sự có mặt của chức amid đặc trưng bởi một nhóm metin liên kết với nitơ ở δH 4,27 (1H, m, H-2) và tín hiệu cacbon cacbonyl ở δC 177,1 (C-1'); hai mạch cacbon dài với các tín hiệu proton metylen ở δH 1,31 (60 H) và proton metyl đầu mạch δH 0,92 (6H, t, J = 6,5 Hz, H-20'
& H-29); hai nối đôi được đặc trưng bởi các tín hiệu proton và cacbon ở δH 5,44 (m, H-8, H-9) tương ứng với δC 131,5 (C-8), 131,4 (C-9) và 5,38 (m, H-10', H-11') tương ứng với δC 130,8 (C-10'), 130,9 (C-11').
Tín hiệu cacbon anome δC 104,7 (C-1') cùng các tín hiệu cacbon khác nhau ở δC 62,7 (C-6''), 71,6 (C-4''), 75,0 (C-2''), 78,0 (C-5'') và 77,9 (C-3''), kết hợp với tín hiệu proton anome δH 4,30 (d, J = 7,5 Hz, H-1'') cho thấy sự có mặt của glucose trong cấu trúc của chất 4T. Các dữ kiện trên cho ta giả thiết hợp chất 4T là một glycosphingolipid tự nhiên [119]. Glycosphingolipid này bao gồm các hợp phần acid béo và bazơ mạch dài cùng với đường glucose.
Phân tích tiếp phổ 1H-NMR còn cho tín hiệu của ba proton hydroxymetin khác chuyển dịch về trường thấp ở δH 3,62,3,53,4,04. Phổ COSY quan sát được tương tác của hai proton metylen ở δH 4,08 (H-1a) và 3,82 (H-1b) với proton metin ở δH
4,27 (H-2), tương tác của hai proton metin ở δH 4,27 với δH 3,62 (H-3), tương tác
của proton metin δH 3,62 với proton metin ở δH 3,53 (H-4). Bên cạnh đó, tương quan HMBC quan sát được của proton ở δH 4,27 (H-2) và cacbon δC 177,1 (C-1'), 75,6 (C-3); δH 3,62 (H-3) và δC 69,9 (C-1), 51,7 (C-2), 72,9 (C-4); δH 4,04 (H-2') và δC 177,1 (C-1') cho phép xác định vị trí liên kết chính xác của ba nhóm hydroxy ở các vị trí C-3, C-4 và C-2'. Độ chuyển dịch của các cacbon ở δC 69,9 (C-1), 51,7 (C- 2), 75,6 (C-3), 72,9 (C-4), 177,1 (C-1'), 72,9 (C-2') trong hợp chất 4T giống với độ chuyển dịch của các cacbon ở vị trí tương ứng của khung (2S,3S,4R,2'R)- phytosphingosine đồng thời độ quay cực riêng của chất 4T được xác định là αD20
= + 11,3° (0,5M/pyridin) [156], [163].
Phổ COSY của chất 4T
Phổ HMBC của chất 4T
Proton anome δH 4,30 (H-1'') tương tác HMBC với cacbon δC 69,9 (C-1) cho phép khẳng định vị trí của liên kết glucosid giữa đường và amid. Các phân tích trên cho phép dự đoán sơ bộ về cấu trúc của sphingoglycolipid này như sau:
2 3 1'
2'
4 HN
O OH
OH OH
R1 R2
GlcO
R1, R2: Mach dài
Để xác định độ dài hai mạch cacbon R1 và R2 luận án sử dụng phương pháp thủy phân và kết hợp khảo sát phổ khối lượng của chất 4T cũng như của sản phẩm như sau: Hợp chất 4T (15 mg) được hòa tan trong hỗn hợp dung môi metanol-acid HCl (5ml, 1M HCl trong 82% aq. MeOH), đun hồi lưu ở 80°C trong 18 giờ [163].
Để nguội phản ứng và chiết với n-hexan. Phần chiết n-hexan sau đó được cô loại dung môi thu được sản phẩm là metyl este của hợp phần acid béo (4.1). Độ dài mạch của hợp phần 4.1 được xác định bởi phổ ESI-MS (neg) với píc ion m/z 339 [M-H]- cho thấy mạch acid béo phải có 20 cacbon và chứa một nối đôi. Như vậy, nối đôi còn lại thuộc về hợp phần amid. Vị trí của nối đôi trong phần acid béo được xác định tại C-10'/C-11' dựa trên các phân mảnh MS/MS của 4.1: m/z 227 [M-H- C8H18]ˉ, m/z 213 [M-H-C9H18]ˉ, m/z 187 [M-H-C11H21]ˉ, m/z 173 [M-H-C12H23]ˉ.
O
O OH
1' 3'
2' 4'
5' 6'
7'
8' 10' 11' 12'
13'
20'
m/z=173 m/z=187
m/z=213 O
O OH
1' 3'
2' 4'
5' 6'
7'
8' 10' 11' 12'
- -
- -
m/z=339 [M-H]-
- m/z=227
O
O OH
1' 3'
2' 4'
5' 6'
7'
8' 10' 11'
O
O OH
1' 3'
2' 4'
5' 6'
7' 8'
O
O OH
1' 3'
2' 4'
5' 6'
7' 8'
9'
Cấu hình của nối đôi này là Z do sự chuyển dịch về trường cao của hai cacbon kề bên C-9 (δC 28,3) và C-12 (δC 28,4) [154], [163].
1' 2'
HN O
OH 10'
3' 11' 4'
5' 6'
7' 8'
12' 13'
20' 19' 18'
H-H COSY HMBC
Trên phổ khối của 4T cho pic ion m/z 962 [M+Na]+, m/z 938 [M-H]ˉ tương ứng với khối lượng phân tử M=939 và công thức phân tử C55H105NO10. Kết hợp với việc xác định được phần acid béo ở trên, ta xác định được độ dài của hợp phần bazơ là 29 cacbon [36]. Phân tích tỉ mỉ các phân mảnh trên phổ khối của 4T như sơ đồ dưới đây, các tương tác COSY và HMBC xác định được vị trí của nối đôi trong mạch bazơ là ở vị trí C-8.
2 3
1' 2'
4
HN O
OH
HO OH O
10' 11'
8 9 3'
10 11
12
29 4'
5'
6' 7'
8'
12' 13'
20'
O H HOHO
OH
OH 19'
18'
23 1
OH OH
3 4 8
9
m/z= 142 m/z = 252
2 3
4
NH OH 8
9 10
11 12
29 1
m/z=436
8 9
10 11
12 5 29
m/z=350 10'
3' 11' 4'
5' 6'
7' 8'
12' 13'
20' 19' 18'
H
16 16
- -
- - m/z=938 [M-H]-
-
Cấu hình của nối đôi này được xác định là E dựa trên sự chuyển dịch về trường thấp của hai cacbon bên cạnh C-7 (δC 33,8) và C-10 (δC 33,7) [154].
2 3
1' 2'
4
HN O
OH
OH OH
R2
O
8 9 3'
10 11
12
29 4'
Glc 23
H-H COSY HMBC
1
Từ các phân tích ở trên, kết hợp với việc đối chiếu, so sánh các dữ kiện phổ của chất 4T với hợp chất codonocerebroside A là hợp chất có cấu trúc tương tự chất 4T chỉ khác ở độ dài mạch cacbon [163] cho phép kết luận cấu trúc hợp chất 4T là 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-
enoylamino]-8-nonacosene-1,3,4-triol.
2 3 1' 2'
4
HN O
OH
OH OH O
10' 11'
8 9 3'
10 11
12
29 4'
5' 6'
7' 8'
12' 13'
20'
O H
HOHO
OH OH
19' 18'
23 1
Theo các tài liệu được cập nhật đây là lần đầu tiên hợp chất này được công bố phân lập từ tự nhiên.
6-Geranyl-7-hydroxy-8-methoxy coumarin (5T)
Hợp chất 5T phân lập ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng. Hợp chất này được xác định là một geranyl coumarin dựa trên các đặc trưng của phổ cộng hưởng từ.
Phổ 1H-NMR của 5T xuất hiện tín hiệu của ba proton thơm của vòng coumarin tại δH 6,16 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3), 7,31 (1H, s, H-5), 7,88 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-4), mạch nhánh geranyl với các proton ở δH 3,26 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-1'), 5,28 (1H, d, J = 14,0 Hz, H-2'), 1,99 (2H, d, J= 15,0 Hz, H-4'), 2,05 (2H, d, J = 14,5 Hz, H-5'), 5,07 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-6'), 1,66 (3H, s, H-8'), 1,54 (3H, s, H-9'), 1,61 (3H, s, H-10'). Phổ 13C-NMR của 5T cho tín hiệu của 20 nguyên tử cacbon, bao gồm 9 cacbon của vòng coumarin δC 111,3 (C-3), 111,4 (C-10), 121,6 (C-5), 125,8 (C-6), 135,8 (C-4), 146,1 (C-7), 144,9 (C-9), 151,3 (C-8), 159,9 (C-2) và nhóm metoxy gắn vào C-8 ở δC 60,9 (-OCH3); mạch geranyl với δC 27,5 (C-1'), 122,6 (C-2'), 133,8 (C-3'), 39,7 (C-4'), 26,1 (C-5'), 124,0 (C-6'), 130,7 (C-7'), 25,4 (C-8'), 15,5 (C-9'). Phổ ESI-MS của 5T cho pic ion giả phân tử tại m/z 327 [M-H]- và phù hợp với công thức phân tử C20H24O4.
10
9 2
3 5 4
6 7
8 1' 2' 3' 4'
10' 5' 6' 7' 8'
9'
O O
HO
OCH3
Từ việc phân tích các dữ kiện phổ trên, so sánh với tài liệu tham khảo [97] cho phép xác định cấu trúc của 5T là 6-geranyl-7-hydroxy-8-methoxy-coumarin. Đây là công bố đầu tiên về sự có mặt của hợp chất này trong P. perfoliatum cũng như chi Polygonum.
3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (6T)
Phổ 1H-NMR của 6 chỉ xuất hiện 2 tín hiệu singlet tại δH 7,535 (1H, s, H-5') và 7,533 (1H, s, H-5) được xác định là hai proton của vòng benzen. Tín hiệu singlet tại δH 6,38 (2H, s, H-3a) cho thấy sự có mặt của 2 proton methylenedioxy. Ngoài ra, nhóm methoxy được xác định bởi tín hiệu ở δH 4,05 (3H, s).
Phổ 13C-NMR và DEPT của 6T cho thấy hợp chất này có 15 C trong đó 12 tín hiệu δC 110,9 (C-1'), 112,1 (C-5'), 103,8 (C-5), 116,0 (C-6'), 116,0 (C-6), 112,7 (C- 1), 140,2 (C-3'), 131,0 (C-2), 138,3 (C-3), 141,6 (C-2'), 150,0 (C-4), 150,0 (C-4') thuộc về hai vòng benzen với 10 C và 2 CH. Ngoài ra, hai tín hiệu cacbon cacbonyl xuất hiện tại δC 157,6 (C-6'a), 158,3 (C-6a), rất đặc trưng cho cặp este vòng (lacton) trong các dẫn xuất của acid ellagic. Sự có mặt của nhóm CH2 liên kết với 2 nguyên tử O và nhóm methoxy lần lượt tại δC 104,3 (C-3a) và 60,9 (s, 3-OCH3).
O
O
OH
O 1
3 6
O 6a
O 1' 3'
6' 6'a O
OCH3
3a
Căn cứ vào các phân tích ở trên đồng thời so sánh với các dữ kiện phổ đã được công bố trước đó [20], [94], cấu trúc của chất 6T được xác định là 3'-O-methyl-3,4- methylenedioxyellagic acid. Đây là công bố đầu tiên về sự có mặt của hợp chất này trong chi Polygonum.
Physcion (7T)
Phổ 1H-NMR của chất 7T cho hai tín hiệu proton singlet ở δH 12,27 (1H, s, 8- OH), 12,08 (1H, s, 1-OH) đặc trưng cho hai nhóm hiđroxi tạo liên kết hiđro với nhóm cacbonyl; tín hiệu của hai cặp proton meta của vòng thơm δH 7,33 (1H, s, H- 4), 7,59 (1H, s, H-5), 6,65 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2), 7,05 (1H, s, H-7); một nhóm metyl vòng thơm của một anthraquinon δH 2,44 (3H, s, CH3) và một nhóm metoxi δH 3,93 (3H, s, OCH3). Sự có mặt của 2 nhóm cacbonyl liên hợp ở δC 190,7 (C-9), 181,9 (C-10), 6 nối đôi ở δC 106,7 (C-4), 108,1 (C-2), 110,2 (C-9a), 113,6 (C-8a), 121,2 (C-5), 124,4 (C-7), 133,2 (C-10a), 135,2 (C-4a), 148,4 (C-6), 162,5 (C-8), 165,1 (C-1), 166,5 (C-3) được nhận ra khi tiếp tục khảo sát phổ 13C-NMR, DEPT của chất 7T. Các dữ kiện phổ trên cho giả thiết về một anthraquinon có các nhóm peri-hiđroxi ở vị trí C1 và C8.
O
O
1
3 5 4
6 8
9 10
8a 9a
10a 4a OCH3
H3C
OH OH
Kết hợp với tài liệu tham khảo [34] vị trí chính xác của các proton và cacbon được khẳng định và cấu trúc của 7T đã được xác định là 1,8-dihydroxy-3-methoxy- 6-methylanthraquinon hay physcion.
4-Hydroxymellein (8T)
Phổ 1H-NMR của chất 8T cho sáu tín hiệu proton thuộc về một coumarin khung mellein, trong đó ba tín hiệu proton đặc trưng cho vòng thơm ở trường thấp với δH 7,09 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-5), 7,58 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-6), 6,95 (1H, dd, J = 1,0, 7,5 Hz, H-7) và ba tín hiệu proton chuyển dịch về trường cao hơn δH 4,55-4,58 (2H, H-3 & H-4), 1,48 (3H, d, J = 6,5 Hz, 3-CH3). Phổ 13C-NMR và DEPT cho nhận định rõ nét hơn về cấu trúc của hợp chất 8T với tín hiệu của cacbon cacbonyl ở δC 170,2 (C-1), hai nhóm metin chuyển dịch về trường thấp do nằm cạnh dị tố (oxy) δC 81,6 (C-3), 69,5 (C-4), nhóm metyl δC 18,2 (3-CH3) và cacbon vòng thơm δC 144,1 (C-4a), 117,7 (C-5), 137,8 (C-6), 117,8 (C-7), 162,9 (C-8), 108,0 (C-8a).
Các dữ kiện phổ trên được so sánh với tài liệu tham khảo [18] cho kết luận về cấu trúc của 8T là 4-hydroxymellein.
O O OH
OH
1 4 3 5
8
Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây thồm lồm gai.
Daucosterol (9T)
Hợp chất 9T được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc. 283-285°C. Rf = 0,41 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 9/1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%.
O O H HOHO
OH OH
Dựa vào các tính chất vật lý, dữ kiện phổ 1H-NMR, kết hợp sắc ký đối chứng với hợp chất β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid chuẩn, tham khảo tài liệu [109]
cho phép kết luận về cấu trúc của hợp chất 9T là β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranosid hay daucosterol.
Quercetin (10T)
Phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của chất 10T cho các tín hiệu đặc trưng của một flavonol. Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó 3 tín hiệu tương tác ABX ở δH 7,82 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 7,69 (1H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz, H-6'), 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5') thuộc về vòng thơm B, hai tín hiệu proton tương tác meta ở δH 6,51 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,26 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) thuộc về vòng thơm A.
O
O OH HO
OH
OH OH
2 3 6 4
8
10 1'
4'
6'
Phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra chất 10T gồm 15 cacbon với 5 CH nhân thơm ở δC 99,1 (C-6), 94,4 (C-8), 115,7 (C-2'), 116,2 (C-5') và 121,4 (C-6'), 10 C trong đó tín hiệu δC 176,5 ppm đặc trưng cho nhóm cacbonyl, bốn cacbon có độ chuyển dịch δC 145,8, 148,3, 162,3, 164,9 ppm đặc trưng cho dạng liên kết của nhân thơm với nhóm OH của các cacbon C-3', C-4', C-5, C-7. Ngoài ra, tín hiệu của cacbon ở δC
136,7 (C-3) đặc trưng cho cacbon của nối đôi liên kết với một nhóm hydroxyl.
Dựa vào dữ kiện phổ trên đồng thời so sánh điểm nóng chảy và so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố trước đó [14], cấu trúc của chất 10T được xác định là 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone hay quercetin.
3,3',4-Trimethoxy 4'-O--L-rhamnopyranosid ellagic acid (11T)
Hợp chất 11T nhận được dưới dạng chất rắn không màu, nhiệt độ nóng chảy 221-222oC. Phổ 1H-NMR của 11T xuất hiện 2 tín hiệu singlet của hai proton vòng benzen tại H 7,70 (1H, s, H-5') và 7,41 (1H, s, H-5). Phân tử đường rhamnose được đặc trưng bởi tín hiệu doublet tại H 5,54 với hằng số J = 1,0 Hz của proton anome ở vị trí α, tín hiệu của nhóm metyl bậc một H 1,15 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6''), và các tín hiệu của nhóm oximetin khác tại H 3,97 (1H, brs, H-2''), 3,71 (1H, dd, J = 3,0;
9,0 Hz, H-3''), 3,36 (1H, H-4''), 3,52 (1H, m, H-5''). Ngoài ra 3 nhóm metoxi được xác định tại H 4,05 (2x3H, s, 4-OCH3 & 3'-OCH3), 4,03 (3H, s,3-OCH3).
Phổ 13C-NMR và DEPT của 11T chỉ ra sự có mặt của 23 nguyên tử cacbon, trong đó tín hiệu 10 C và 2 CH thuộc về hai vòng benzen được xác định tại C 114,2 (C-1'), 111,6 (C-5'), 111,6 (C-5), 112,4 (C-6'), 111,8 (C-6), 110,8 (C-1), 141,8 (C- 3'), 140,9 (C-2), 140,1 (C-3), 141,4 (C-2'), 152,8 (C-4), 150,3 (C-4'). Ngoài ra, 3 nhóm metoxi tại C 60,9 (s, 3-OCH3), 61,5 (3'-OCH3), 61,5 (4-OCH3). Phân tử đường rhamnose xác định tại C 17,9 (C-6''), 70,1 (C-2''), 70,3 (C-5''), 70,5 (C-3''),
71,6 (C-4''), 99,9 (C-1''). Hai tín hiệu tại C 158,1 (C-7'), 158,3 (C-7) rất đặc trưng cho cacbon của cặp este vòng (lacton) trong các dẫn xuất của ellagic acid. Thông thường khi tạo este nội vòng, giá trị C đều xuống thấp, nhưng phổ biến vẫn phải có giá trị lớn hơn 164-165 ppm; riêng các dẫn xuất của ellagic acid, cặp hai giá trị C của cacbon cacbonyl đều từ 158-160 ppm do đặc trưng cấu trúc riêng biệt của nó.
Mặt khác, với 14 nguyên tử cacbon (nếu chưa xét đến phân tử đường và 3 nhóm metoxi) nhưng chỉ có 2 tín hiệu CH chứng tỏ hai vòng benzen đã thế tới 10 vị trí.
Điều này cho phép nhận định hợp chất 11T là một dẫn xuất của ellagic acid với 4 nhóm thế vào các vị trí OH trong đó có 3 nhóm metoxi và 1 phân tử đường rhamnose. Các giá trị C của chất 11T ở vùng đường C 99,9 (C-1''), 70,1 (C-2''), 75,0 (C-3''), 71,6 (C-4''), 70,3 (C-5''), 17,9 (C-6'') cho thấy các giá trị này phù hợp với đường rhamnose. Các giá trị C và H được xác định thông qua phân tích các phổ HMBC.
Phổ HMBC chỉ ra tương tác của H-5 với C-4, C-6, C-3, C-1, C-7 cũng như tương tác của hai proton metoxi với C-4 và C-3, chứng tỏ hai nhóm metoxi nối với C-3 và C-4 đồng thời khẳng định các giá trị C của C-1 đến C-7. Tương tự như vậy, tương tác HMBC của H-5' với C-1', C-3', C-4' C-6', C-7', tương tác của H-1'' với C- 4' và proton metoxi với C-3' khẳng định các giá trị độ dịch chuyển hóa học của vòng benzen thứ hai cũng như vị trí nối của phân tử đường vào C-4' và nhóm metoxi vào C-3'.
O
O
O H3CO 1
3 2 4
5 6 7
1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''
O OH OH HO CH3 O
O
OCH3
H3CO
1'2' 3' 4' 6'5' 7'
O
O
O H3CO 1
O OH OH CH3OH O
O
OCH3
H3CO
Từ các dữ kiện phổ trên kết hợp với tài liệu tham khảo [157] hợp chất 11T được xác định là 2,3,8-trimethylether 4'-rhamnosid ellagic acid hay 3,3',4- trimethoxy 4'-O--L-rhamnopyranosid ellagic acid. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây thồm lồm gai.
Myricetin (12T)
Phổ ESI-MS của hợp chất 12T cho pic ion ở m/z 319 [M+H]+, 317 [M-H]¯, tương ứng với khối lượng phân tử M=318, phù hợp với công thức phân tử C15H10O8.
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu đặc trưng của một flavonol với hai tín hiệu của vòng A tương tác meta ở δH 6,37 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,18 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6), một tín hiệu singlet có δH 7,24 (2H, s, H-2' & 6') là các proton trên vòng B đối xứng, không mang nhóm thế.
Phổ 13C-NMR của hợp chất 12T cho 12 tín hiệu cộng hưởng ứng với 15 cacbon gồm δC 175,7 ppm đặc trưng cho cacbon cacbonyl. Ngoài ra, tín hiệu của cacbon ở δC 135,8 (C-3) đặc trưng cho cacbon nối đôi liên kết với một nhóm OH.
O HO
OH O
OH OH
OH 1
2 4 3 5
7 9
10
1' 2'
3'
6' OH
Các tín hiệu cacbon còn lại đều phù hợp với dữ liệu phổ đã công bố [40] cho hợp chất 3',4',5',5,7-pentahydroxyflavonol hay myricetin. Từ đây kết luận hợp chất 12T là myricetin.
Acid chlorogenic (13T)
Hợp chất 13T được phân lập dưới dạng bột màu trắng.
Phổ 1H-NMR của 13T cho các tín hiệu proton của một vòng benzen thế 1,3,4 ở δH 7,15 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 7,03 (1H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-5'), 6,87 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6'). Cặp tín hiệu proton δH 7,53 (1H, d, H-7'), 6,25 (1H, d, H-8') với hằng số ghép cặp J = 16,0 Hz chứng tỏ sự có mặt của một liên kết đôi với cấu hình trans. Ngoài ra trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của ba proton liên kết với cacbon cạnh dị tố (CH-O) ở δH 5,38 (1H, m, H-3), 3,78 (1H, dd, J = 3,0; 9,0 Hz, H- 4), 4,23 (1H, quartet, H-5) và tín hiệu của một cặp proton metylen ở δH 2,25 (1H, brd, H-2b), 2,02 (1H, brd, H-2a).
Phổ 13C-NMR của 13T xuất hiện tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon bao gồm hai nguyên tử cacbon cacbonyl với δC 175,1 (C-7), 167,1 (C-9'); hai cacbon olefin và sáu cacbon thơm δC 127,6 (C-1'), 115,2 (C-2'), 145,8 (C-3'), 148,7 (C-4'), 116,4 (C-5'), 122,5 (C-6'), 146,3 (C-7'), 115,9 (C-8'), bốn cacbon CH-O- ở 76,2 (C-1), 71,3 (C-3), 73,5 (C-4), 71,6 (C-5) và hai cacbon metylen 37,9 (C-6), 39,1 (C-2).
O O HO
O OH HO
OH
OH OH 2 1
3 6 4 5
9' 8' 7'
1' 2' 3' 5' 4' 6'
Từ các dữ kiện phổ trên cho ta hình dung về cấu trúc một dẫn xuất của acid caffeic, kết hợp tham khảo tài liệu [135] hợp chất 13T được khẳng định là 3-(3,4- dihydroxycinnamoyl)quinate hay acid chlorogenic.
4',5,7-Trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavone (14T)
Hợp chất 14T thu được dưới dạng chất rắn màu vàng.
Phổ ESI-MS xuất hiện các píc ion m/z 329 [M-H]-, 353 [M+Na]+, 331 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C17H14O7.
Phổ 1H-NMR của 14T cho các tín hiệu đặc trưng của một flavonoid với cặp hai tín hiệu tại H 6,20 và 6,55 đều dưới dạng doublet (J = 2,0 Hz) điển hình của hai proton H-6 và H-8 của vòng A, tín hiệu singlet H 6,95 (1H, H-3) được xác định là proton thuộc vòng C. Tín hiệu singlet tương ứng với 2H tại H 7,31 cho thấy vòng B thế các vị trí C-3', C-4', C-5' và còn lại hai proton H-2' và H-6'. Căn cứ vào tín hiệu singlet tại H 3,88 (6H, s, 2 x OCH3) có thể thấy hai nhóm metoxy này phải nối với C-3' và C-5', như vậy tại các vị trí C-5, C-7, C-4' sẽ là các nhóm hydroxyl.
Phổ 13C-NMR của 14T cho thấy hợp chất này có 17 nguyên tử cacbon, trong đó 15 cacbon thuộc vào khung flavon và 2 cacbon còn lại là của nhóm metoxi. Tín hiệu cacbon cacbonyl tại C 181,8 cho thấy sự có mặt của nối đôi C-2/C-3. Tại các vị trí C-3', C-4' và C-5', giá trị C của C-4' thấp hơn C-3', C-5' phù hợp với sự metyl hóa nhóm hydroxyl trong phổ NMR.