3.7.1. Khảo sát hoạt tính độc tế bào
Chuẩn bị cặn chiết: Các mẫu nguyên liệu thực vật ở các phần khác nhau được nghiền thành bột sau đó đem chiết với các dung môi metanol, etanol 90%, nước ở nhiệt độ phòng (25oC). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở 40oC thu được các phần cặn chiết tương ứng và được bảo quản ở –20oC.
Nuôi cấy tế bào: Tế bào MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR được nuôi cấy trong DMEM chứa 10% FBS. Tế bào Hela và HT-1080 được nuôi cấy trong RPMI chứa 10% FBS. Các dòng tế bào sau đó được ủ ở 37oC trong tủ ấm chứa 5% CO2.
Tiến hành thử độc tế bào (MTT assay): Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% ở các thang nồng độ gồm 5 nồng độ 1, 3, 10, 30, 50 μg/mL. Tamoxifen được sử dụng làm chứng dương.
Quy trình nuôi cấy: Cho khoảng 2x104 tế bào/ml trong môi trường nuôi cấy.
Để 2 giếng trống làm chứng trắng (blank control). Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37oC và 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy.
Nuôi tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định. Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 10 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ được lặp lại ở 3 giếng. Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường. Ủ đĩa nuôi cấy từ 72 giờ (37oC, 5% CO2)cho phép thuốc phát huy tác dụng. Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi. Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml.
Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy. Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa. Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy. Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO. Lắc kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn. Đọc mật độ quang ở bước sóng 550 nm. Mật độ quang sẽ phản
ánh số lượng tế bào (TB) sống sót. % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau:
% TB sống = [OD540 của TB được xử lý]/[OD540 của TB không được xử lý thuốc] x 100%
- Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Excel.
3.7.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
3.7.2.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết.
Đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH
Mẫu thử: Cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu được điều chế như mục 3.3.2. Tiến hành: theo tài liệu [133], chỉnh sửa nhỏ để phù hợp với điều kiện thực tế. Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,06 mM trong metanol. Dung dịch này không bền với ánh sáng, chỉ pha trước khi dùng. Pha các dung dịch thử trong metanol cú nồng độ thớch hợp (từ 20-150 àg/ml).
Ống thử: 300àl dung dịch thử + 3ml dung dịch DPPH. Ống chứng: 300àl metanol + 3ml dung dịch DPPH. Lắc đều các ống trong 15 giây, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và đo quang ở bước sóng 517 nm.
Hoạt tính chống oxy hóa (I) được tính theo công thức:
I% = (A chứng – A thử) / A chứng x 100. Trong đó: A là mật độ quang.
Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Sử dụng phương pháp đường chuẩn để tính IC50. Acid ascorbic được sử dụng làm chứng dương.
Phương pháp định lượng ABTS•+
Dung dịch gốc ABTS•+ được pha từ 7mM ABTS•+ và 2,45 mM kali persulfat với tỉ lệ thể tích 1:1, sau đó được ủ trong tối trong vòng 16 giờ tại nhiệt độ phòng và được sử dụng trong vòng 2 ngày.
Dung dịch thao tác phản ứng ABTS•+ được pha loãng từ dung dịch gốc trong đệm phosphate 7,4 tới độ hấp thụ 0,70 ± 0,05 tại 734 nm. Pha các dung dịch thử trong metanol cú nồng độ thớch hợp (từ 20-150 àg/ml).
Sau đú, 30 àL dung dịch mẫu thử được trộn với 3 mL dung dịch thao tỏc. Hỗn hợp này được ủ tại nhiệt độ phòng trong 6 phút. Đo độ hấp thụ ánh sáng của hỗn hợp này tại bước sóng 734 nm. Khả năng dọn gốc tự do được tính theo công thức:
SA(%) = 100 x (A chứng – A thử) / A chứng Trong đó: A là mật độ quang.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng phương pháp đường chuẩn để tính IC50. Trolox được sử dụng làm chất chứng dương.Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SD, tính toán bằng Excel và phần mềm thống kê GraphPad Prism 6.0 3.7.2.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các chất tinh khiết
Mẫu thử: Là 14 chất tinh khiết được chọn ra từ các chất phân lập của ba đối tượng nghiên cứu bao gồm 3T, 5T, 6T, 21T, 22T, 23T, 27N, 28N, 31N, 36N, 37N, 50M, 54M, 55M.
Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong metanol. Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 256, 64, 16, 4, 1 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy Genios Tecan ở bước sóng 517 nm.
Khả năng bắt gốc tự do DPPH (SC%) của mẫu thử được tính theo công thức sau:
SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%). Trong đó: OD mẫu thử (trắng) là giá trị mật độ quang của giếng chứa mẫu thí nghiệm (mẫu trắng). EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH
y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938
0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000
0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM
Mật độ quang học (OD)