CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Các bước thực hiện
Tiếp nhận bệnh nhân, lấy số liệu dịch tễ, lâm sàng:
Chọn ngẫu nhiên tất cả bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu và không có tiêu chuẩn loại trừ.
Làm thủ tục mời tham gia nghiên cứu: Giải thích các lợi ích, nguy cơ và sự an toàn đối với bệnh mũi xoang và sức khỏe nói chung. Giải thích sự riêng tư và bảo mật khi tham gia nghiên cứu. Ký giấy chấp thuận tham gia nghiên cứu.
Kiểm tra kỹ toa thuốc trước khi nhập viện, đảm bảo bệnh nhân không sử dụng steroids uống hay xịt mũi tối thiểu 3 tuần trước khi lấy mẫu. Nếu bệnh nhân có uống hay xịt mũi steroids trong 3 tuần trước đó, dặn bệnh nhân ngưng sử dụng và trở lại nhập viện sau 3 tuần[30],[44].
Làm bệnh án theo mẫu bệnh án nghiên cứu. Lưu ý các tiền căn hen phế quản, dị ứng, hút thuốc lá.
Lấy số liệu SNOT-22 theo bảng mẫu khi làm bệnh án và sau điều trị steroids 3 tuần.
Nội soi mũi ngay trước và sau khi điều trị steroids 3 tuần. Chụp CT scan mũi xoang không cản quang ngay trước khi điều trị steroids.
Xếp 5 độ theo Hadley, Đại học Florida, Hoa Kỳ dựa trên kết quả nội soi và CT scan:
₋ Độ 1: Polyp còn trong khe mũi giữa
₋ Độ 2: Polyp vượt quá bờ tự do cuốn mũi giữa, chưa tới chân bám cuốn mũi dưới
₋ Độ 3: Polyp vượt quỏ chõn bỏm cuốn mũi dưới, chưa tới ẵ cuốn mũi dưới
₋ Độ 4: Polyp vượt quỏ ẵ cuốn mũi dưới, chưa tới bờ tự do cuốn mũi dưới
₋ Độ 5: Polyp vượt quá bờ tự do cuốn mũi dưới
Hình 2.6. Xếp 5 độ polyp mũi theo Hadley, Đại học Florida, Hoa Kỳ
“Nguồn: T. Metin ệnerci, 2010”[15]
Lấy mẫu mô polyp mũi:
BN không uống và không xịt mũi steroids tối thiểu 3 tuần trước khi lấy mẫu[30],[44].
Sinh thiết trước điều trị:
+ Sinh thiết polyp mũi tại phòng khám bằng kìm cắt.
+ Lấy mẫu mô polyp bao gồm lớp niêm mạc và lớp dưới niêm.
Điều trị steroids: theo phác đồ 3 tuần của EPOS 2012[30]
+ Methylprednisolone uống: tuần đầu: 16mg tuần thứ 2-3: 8mg.
+ Fluticasone xịt mũi: ngày 2 lần, lần 2 nhát/bên.
Sinh thiết sau điều trị steroids 3 tuần:
+ Trường hợp polyp nhỏ lại (giảm độ): Sinh thiết polyp mũi tại phòng khám bằng kìm cắt.
+ Trường hợp polyp không nhỏ lại (không giảm độ): phẫu thuật nội soi mũi xoang theo phương pháp Stamberger-Kennedy, đuổi theo
bệnh tích polyp, lấy bỏ tận chân polyp bằng kéo phẫu thuật nội soi hoặc kìm cắt, làm sạch hố mổ bằng dao cắt hút.
Mẫu mô được chia 2 phần: một cố định bằng formaldehyde 10%, và một cố định bằng dung dịch RNA later (của công ty Ambion, Mỹ).
Xử lý mẫu mô polyp:
Không cho bội nhiễm: cho mẫu mô vào lọ đựng dung dịch cố định ngay sau khi lấy ra khỏi mũi.
Cố định mẫu mô 1 trong formaldehyde 10% trong 24 giờ, chuyển về khoa Giải phẫu bệnh bệnh viện Nhân Dân Gia Định để đúc khối nến, cắt lỏt mỏng (3àm) trải lờn lam, nhuộm HE, đọc xỏc định chẩn đoỏn polyp mũi và kiểm tra chất lượng khối nến.
Khối nến đạt yêu cầu sẽ được vận chuyển đến phòng xét nghiệm tế bào và phân tử thuộc Trung tâm Nghiên cứu Lâm sàng-Đại học Quốc Gia Singapore do chính NCS mang đi.
Khối nến được cắt lỏt mỏng (3 àm) trải lờn lam và nhuộm mụ:
Nhuộm HE để đọc bạch cầu ái toan, nhuộm hóa mô miễn dịch để đọc bạch cầu trung tính.
Nhuộm hóa mô miễn dịch để đọc tế bào lympho TH1, TH2, T-reg.
Các kháng thể đặc hiệu cho TH1 là T-bet, TH2 là GATA-3, T-reg là FOXP3.
Các bước, kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch được trình bày chi tiết trong “Bảng hướng dẫn nhuộm hóa mô miễn dịch” ở phần phụ lục[44].
Cố định mẫu mô 2 trong 1mL dung dịch RNA Later để thực hiện xét nghiệm ly trích các mRNA biểu hiện của gen FOXP3 và hGRα trong mô polyp mũi.
Lọ đựng mẫu được giữ ở nhiệt độ -200C trong suốt quá trình trữ, vận chuyển đến phòng xét nghiệm tế bào và phân tử thuộc Trung tâm Nghiên cứu Lâm sàng-Đại học Quốc Gia Singapore (nghiên cứu gen FOXP3) và Phòng xét nghiệm Sinh học Công ty Nam Khoa (nghiên cứu gen hGRα).
Các bước ly trích mRNA bao gồm:
Chuẩn bị dung dịch rửa mẫu mô
Chuẩn bị các thiết bị ly trích mRNA
Định dạng và định lượng mẫu mô
Ly giải mô và tế bào
Chiết xuất bỏ các chất hữu cơ
Ly trích RNA
Kiểm tra chất lượng và nồng độ RNA sau khi ly trích.
Quá trình ly trích RNA được trình bày chi tiết trong Bảng hướng dẫn ly trích RNA ở phần phụ lục.
Thu thập số lượng bạch cầu ái toan, bạch cầu trung tính, tế bào Lympho TH2, TH1, T-reg trong mô polyp mũi:
Dưới kính hiển vi quang học, đếm và tính tỉ lệ bạch cầu ái toan, bạch cầu trung tính, tế bào Lympho TH1, TH2, T-reg trong khoảng 200 bạch cầu. Để đếm được 200 bạch cầu, chúng tôi chọn 5 vi trường HPF (400x) tập trung tế bào nhiều nhất, chọn trong 3 lam của cùng mẫu mô.
Mỗi lam được đọc bắt đầu từ màng đáy. Đếm các loại tế bào bạch cầu thì dựa vào hình dạng và màu sắc. Đếm tế bào lympho TH1, TH2, T-reg thì dựa vào các kháng thể đặc hiệu: TH1 là T-bet, TH2 là GATA-3, T- reg là FOXP3.
Số lượng tế bào được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn theo cách tính biến số liên tục của thống kê.
Mô polyp được xem là ưu thế bạch cầu ái toan hay bạch cầu trung tính khi tỉ lệ các bạch cầu ái toan hay bạch cầu trung tính ≥10%.
Ngưỡng được chọn là 10% dựa vào phương pháp của Wenzel. Một loại tế bào được gọi là ưu thế khi số lượng tế bào cao hơn gấp đôi độ lệch chuẩn của giá trị trung bình của nhóm chứng (4,77% + 2 x 2,47% = 9,71%). Do đó chúng tôi chọn 10% làm ngưỡng xếp loại ưu thế tế bào[69].
Người phụ trách kỹ thuật nhuộm mô: TS.Li Chunwei.
Người đọc kết quả tế bào: NCS. Nguyễn Nam Hà.
Người kiểm tra lại kết quả đọc: TS. Li Chunwei, GS.TS. Wang De Yun (Đại học Quốc Gia Singapore).
Thu thập chỉ số biểu hiện gen FOXP3 và hGRα trong mô polyp mũi:
mRNA toàn phần được sao chép ngược cDNA sử dụng bộ xét nghiệm
“TaqMan Reverse Transcription Reagents kit” của công ty Applied Biosystems, Mỹ.
Kỹ thuật được sử dụng: real-time RT-qPCR sử dụng Taqman để đánh giá biểu hiện gen[44].
Với gen FOXP3, cặp mồi được sử dụng để nhân bản vùng gen trên cDNA của gen FOXP3 là 5’-GCTTCATCTGTGGCATCATCC-3′ và 5′-GAGTCTGCACAAGTGCTTTGT-3’. Vị trí của các cặp mồi này tương ứng là tại nucleotide 993-1013 và 1355-1375[45].
Với gen hGRα, cặp mồi được sử dụng để nhân bản vùng gen trên cDNA của gen hGRα là 5’-CCTAAGGACGGTCTGAAGAGC-3' và 5'-GCCAAGTCTTGGCCCTCTAT-3'. Vị trí của các cặp mồi này tương ứng là tại nucleotide 2158-2178 và 2616-2635[25].
Sử dụng gen tham chiếu GAPDH đối với gen FOXP3 và gen tham chiếu β-actin đối với gen hGRα làm chất đối chứng.
Mẫu chứng dùng để làm nền cho mức độ biểu hiện gen là mẫu mô niêm mạc vách ngăn mũi dư ở bệnh nhân vẹo vách ngăn không có viêm xoang được phẫu thuật chỉnh hình vách ngăn mũi (danh sách ở phụ lục).
Chỉ số biểu hiện gen được tính toán theo phương pháp so sánh 2-∆∆Ct của Kenneth JL:
Tỉ số mức độ biểu hiện gen mục tiêu giữa mẫu khảo sát so với mẫu hiệu chuẩn được tính bằng công thức 𝑛 = 2−∆∆𝐶𝑇.
Trong đó: ∆∆CT = ∆CT,sample− ∆CT,Cb.
Cách tính toán số liệu thực tế phương pháp 2−∆∆CT:
Mẫu IC Target ∆CT ∆∆CT
Sample A ± a B ± b (B − A) ± √a2+ b2 [(B − A) − (D − C)]
± √a2+ b2+ c2+ d2 Cb C ± c D ± d (D − C) ± √c2+ d2
Trong đó:
A: CT gen IC (GAPDH hoặc β-Actin) của mẫu bệnh a: Sai số CT của gen IC của mẫu bệnh
B: CT gen đích (FOXP3 hoặc hGRα) của mẫu bênh b: Sai số Ct gen đích của mẫu bệnh
C: CT gen IC (GAPDH hoặc β-Actin) của mẫu chứng c: Sai số CT gen IC của mẫu chứng
D: CT gen đích (FOXP3 hoặc hGRα) của mẫu chứng d: Sai số CT gen đích của mẫu chứng
Phụ trách kỹ thuật ly trích mRNA: TS.Li Chunwei, TS. Phạm Hùng Vân.
Đọc kết quả chỉ số biểu hiện gen: NCS. Nguyễn Nam Hà.
Người kiểm tra lại kết quả đọc: GS.TS. Wang De Yun, TS. Phạm Hùng Vân.