Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương

1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương

Cho đến nay, các nhà công nghệ sinh học phân tử đã và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm vi khuẩn, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực vật, động vật có vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào… Trong các hệ thống trên, thực vật có nhiều lợi thế trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp, bởi vì: (1) Khả năng glycosit hoá các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch; (2) Protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao; (3) Thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với

chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc và nguyên liệu đầu vào, cho nên giá thành thấp.

Nhiều phương pháp chuyển gen đã được ứng dụng để tạo cây chuyển gen, nhưng phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển trực tiếp đƣợc ứng dụng và thu đƣợc những kết quả khả quan.

Phương pháp chuyển gen trực tiếp là phương pháp chuyển DNA thông qua xử lý polyethylene glycol (PEG). Đây là phương pháp chuyển gen cho hiệu quả cao. Bằng phương pháp này đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua các thế hệ. Theo phương pháp này, gen được chuyển trực tiếp và tế bào thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật có thể kể đến là (i) Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện, (ii) Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm, (iii) Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn, (iv) Chuyển gen nhờ súng bắn gen và (v) Chuyển gen nhờ silicon carbide.

Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng đƣợc bao bọc bởi DNA và chuyển vào mô tế bào nhờ súng bắn gen. Ƣu điểm của phương pháp này là thao tác dễ dàng, biến nạp gen vào được nhiều tế bào, nguyên liệu đa dạng, nhƣ hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào của các mô biệt hóa và mô phân sinh. Phôi soma đầu tiên đƣợc sử dụng nhƣ vật liệu đích đối với kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens và sau này nhiều tác giả cho thấy phôi soma có thể sử dụng tốt cho kỹ thuật sử dụng súng bắn gen 73 101 và phôi chuyển gen thường được tạo ra sau 7 tuần kể từ khi sử dụng súng bắn gen để biến nạp gen chuyển vào phôi 56 , các khối mô đồng nhất đã chuyển gen có thể tạo ra sự biệt hóa. Vì vậy phôi soma đã đƣợc sử dụng để đánh giá đặc tính của hạt chuyển gen trước khi tạo cây hoàn chỉnh, và sau đó là quá trình chọn lọc các dòng cây chuyển gen tái sinh đƣợc thực hiện 79 51 .

Cây đậu tương đầu tiên được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen sử dụng súng bắn gen vào thân mầm hạt đậu tương từ năm 1988 , đến nay phương pháp chuyển gen này đã đƣợc cải tiến, phát triển và áp dụng cho hầu hết đối với các giống đậu tương để tạo cây đậu tương chuyển gen. Gần đây, hàng loạt công bố về biến nạp thành công trên lúa, đu đủ, mía, bông,…đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp bắn gen 149 . Tuy nhiên nhược điểm của nó là tần số biến nạp còn thấp, cây tạo ra có thể ở dạng thể khảm. Quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen đã đƣợc cải thiện và sử dụng rộng rãi mặc dù vần còn những hạn chế 11 56 58 78 150 .

Khác với các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật, phương pháp chuyển gen gián tiếp đƣợc thông qua vi khuẩn đã đƣợc sử dụng có hiệu quả đối với cây đậu tương. Những vi khuẩn thực hiện quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua các cơ chế rất tự nhiên 156 . Quy trình chuyển gen gián tiếp ở thực vật bao gồm những bước chính như sau: (1) Xác định thông tin về gen liên quan đến đặc tính trạng quan tâm; (2) Phân lập gen; (3) Thiết kế vector chuyển gen; (4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (5) Biến nạp cấu trúc gen chuyển vào mô hoặc tế bào thực vật; (6) Chọn lọc các thể biến nạp; (7) Tái sinh cây biến nạp; (8) Phân tích cây chuyển gen.

Một trong những phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen thông qua loài vi khuẩn đất A. tumefaciens.

1.3.1.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens Vi khuẩn A. tumefaciens

Agrobacterium là loài vi khuẩn đất gram (-) gây bệnh ung thƣ ở thực vật và có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên từ loài thực vật này sang loài thực vật khác 16 . Agrobacterium có thể gây bệnh khối u (A. tumefaciens) và gây bệnh rễ tơ (A.rhizogenes) phổ biến ở nhiều loài thực vật 11 .

Trong tự nhiên, ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm thường gặp một loại khối u gồm khối các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ

chức (Hình 1.4). Những tế bào trong khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống nhƣ tế bào ung thƣ ác tính ở động vật.

Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di truyền và khối u cảm ứng. Khối u di truyền thường xuất hiện ở một vài cặp lai có tính hòa hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài khác của chi thuốc lá Nicotiana hoặc của chi rau cải Brassica.

Hình 1.4. Khối u thực vật do A. tumefaciens [80]

Loại khối u cảm ứng đƣợc biết đến nhiều nhất là mụn cây do loài vi khuẩn A. tumefaciens gây nên [20]. A. tumefaciens là chi vi khuẩn gram âm (-), bao gồm các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất. A.

tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dƣỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây– crown gall disease) [80].

Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này đƣợc nghiên cứu từ nhiều năm nay và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật [80]. A. tumefaciens đƣợc sử dụng nhƣ một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm, chẳng hạn nhƣ A. awamori, A. fumigatus, Penecillium digitatums [66].

Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A.

tumefaciens. Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing). T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn A. tumefaciens [20].

Ti- plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 150 kb – 200 kb (Hình 1.5). Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ. Đó là đoạn T–DNA [65]. T–

DNA đƣợc xác định bởi trình tự ở hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lại ngoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [21].

Hình 1.5. Cấu trúc Ti- Plasmid (nguồn : http://www.biotech.ubc)

Trên T – DNA có các gen tạo khối u. Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gen của tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u [47]. Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T – DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gen mong muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường. Gen tổng hợp opine cần thiết để tổng hợp opine. Hợp chất này không đƣợc tổng hợp trong A.

tumefaciens mà chỉ đƣợc tổng hợp trong tế bào chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp opine chỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn. Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bào chủ tạo ra năng lƣợng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [1].

Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và hệ gen sinh tổng hợp opine. Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen độc khác nhau cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [21]. Khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, các gen gây độc vir đƣợc biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào chủ và khối u đƣợc tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin. Đây là các chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục [20], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình thành các khối u. Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các gen vir sẽ quyết định hình thái khối u. Bên cạnh những gen chức năng, Ti plasmid gồm gen sinh tổng hợp amino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine và loại khác tạo nopanine, vì vậy người ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine. Trình tự nucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp nopalin và octopin [20].

Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn A. tumefaciens

A. tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương. Thực vật bị thương sẽ ứa ra hợp chất amino acid, trong đó đường và acid vô cơ là những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động.

Khi vi khuẩn tiến đến vết thương trên cây, chúng tấn công vào bề mặt và tổng hợp các sợi cellulose, đồng thời thực vật tiết ra các hợp chất phenol, chẳng hạn như acetosyringone (AS), một hợp chất thường được sử dụng để cảm ứng gen vir. Một hệ thống điều hòa gồm hai thành phần cấu thành từ protein độc virA và virG đƣợc hoạt hóa nhờ sự có mặt của AS. Protein nhiễm sắc thể, chvE tương tác với virA làm tăng mức độ biểu hiện của gen vir trong môi trường có hợp chất monosaccharide. AS kích thích virA, một thụ thể liên kết màng, và virA kích thích virG. VirG bị kích thích sẽ tương tác với các yếu tố kích thích trên đoạn khởi đầu (promoter) điều khiển khung đọc (operon) của virA, virB, virC, virD, virE và virG và kết quả là làm tăng mức độ biểu hiện [21].

Hình 1.6. Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens [49]

(1). Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2). Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật đặc trƣng;(3). Sự hoạt hoá của vùng gen vir; (4). T- ADN đƣợc tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirD1/D2; (5). Sự tạo thành phức hợp VirD2- ADN (phức hợp-T chƣa thành thục), cùng với một vài protein Vir khác, đi vào nguyên sinh chất tế bào chủ; (6). Sự kết hợp của VirE2 với sợi-T tạo thành phức hợp-T thành thục đi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ; (7). Phức hợp-T thành thục chủ động đi vào nhân tế bào chủ; (8). T- ADN bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9). T- ADN tách khỏi các protein bảo vệ; (10). T- ADN hợp nhất vào hệ gen chủ

VirC và virD đều bị endonuclease phân cắt, hai gen này liên kết với biên phải của T – DNA và cắt T – DNA sợi đơn ra khỏi Ti plasmid. Ngay lập tức trình tự này liên kết với virE2 để tránh tác dụng của endonuclease và hiện tƣợng tự bắt cặp lại. VirB2 – B11 hình thành T – pilus và kích thích virE2 đã đƣợc bao bọc bởi T – DNA dạng sợi đơn chuyển sang tế bào đích [20].

Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt động cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine. Hormon kích thích sự phát triển của tế bào chủ, opine là nguồn dinh dƣỡng cho vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, cho đến nay người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này. Trong tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ hòa nhập vào hệ gen của tế bào chủ. Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tự gen của tế bào chủ và T – DNA đƣợc chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ tương cao với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng. Tần suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau, nhưng hiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [21].

Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng cách cắt bỏ hầu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir và phần T – DNA tối thiểu mang điểm ghép gen. Loại vector này đang đƣợc sử dụng rất hiệu quả trong việc đƣa DNA lạ vào tế bào chủ [72].

Để chuyển đƣợc các gen mong muốn vào thực vật thông qua A.tumefaciens trước hết cần phải thay đổi cấu trúc của Ti – plasmid. Do Ti – plasmid có kích thước lớn, chứa các gen gây khối u và có nhiều vị trí cắt của enzym giới hạn nên không thể dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen. Để giải quyết vấn đề này người ta tiến hành thiết kế các hệ thống vector dùng cho biến nạp. Trong quá trình này các vùng gen gây ra khối u ở thực vật

sẽ đƣợc cắt bỏ, thay thế vào đó là các gen quan tâm có gắn thêm gen chỉ thị cho chọn lọc.

1.3.1.2. Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn A.

tumefaciens

Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A. tumefaciens là hệ thống vector liên hợp và hệ thống vector nhị thể.

Vector liên hợp (cointegrate)

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn.

Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thƣ và gen tổng hợp opine ở dạng T – DNA hoang dại đều đƣợc thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A. tumefaciens.

Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli;

ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động đƣợc trong E.

coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động đƣợc ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Nhƣ vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ nhƣ một hành khách vào trong tế bào thực vật [1] [20].

Vector nhị thể (binary vector)

Hệ vector nhị thể đặc trƣng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA. Hệ vector nhị thể đƣợc thiết kế bao

gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ đƣợc cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhƣng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể đƣợc thiết kế bao gồm các phần nhƣ sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động đƣợc ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (nhƣ oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác nhƣ đoạn kích thích vận chuyển T – DNA [21] [72] [111].

1.3.1.3 Chuyển gen ở đậu tương nhờ vi khuẩn A.tumefaciens lây nhiễm qua nách lá mầm tổn thương

Vi khuẩn A.tumefaciens là một vector sinh học đƣợc sử dụng để chuyển các gen mong muốn vào cây đậu tương [31] [49] 52 [53]. Tuy nhiên, vi khuẩn không xâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u. Ưu điểm của phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens là đơn giản, dễ sử dụng và chỉ yêu cầu tối thiểu về dụng cụ, dễ dàng chuyển một gen đơn lẻ vào cây chủ hoặc chỉ cần số bản copy thấp [50]. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ở đậu tương trong môi trường đồng nuôi cấy được tiến hành trên lá mầm chưa trưởng thành 88 , hoặc hỗn hợp nuôi cấy phôi thực vật [128]. Khởi nguồn phương pháp này dựa vào kiểu gen đậu tương mẫm cảm với sự lây nhiễm A.