QUA VI KHUẨN A.TUMEFARACIENS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn
Hiện nay người ta đã sử dụng nhiều loại vector chuyển gen mang gen gus trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật nhƣ pBI121, pCAM301, pPTN 289 và các kết quả chuyển gen gus là cơ sở cho sự thành công chuyển gen đích vào thực vật. Hiệu suất của quá trình chuyển gen không chỉ phụ thuộc vào hệ thống tái sinh mà còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó có đặc điểm di truyền của giống. Các nghiên cứu chuyển gen thành công vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn A.tumfaciens qua nách lá mầm đã đƣợc công bố nhƣ nghiên cứu của Bùi Phương Thảo và đtg (2009 ) [22]; Trần Thị Cúc Hòa và đtg (2007) [10], tuy nhiên để tiếp nhận gen của ĐT12 và DT84 theo phương pháp chuyển gen gián tiếp, chúng tôi đã sử dụng vector pPTN289 mang gen gus (pPTN289/gus) biến nạp vào cây đậu tương.
Thí nghiệm chuyển gen gus với tổng số 395 mẫu đối với đậu
tương ĐT12 đối vớ 84, s
A.tumfaciens
inh kanamycine (Kan) (H 3.22). Khi chuyển sang Kan 50 mg/l, kết quả
ĐT12 84),t ĐT12 khi nhuộm bằng X-gluc (Hình 3.23).
3.22
(B)
Nhƣ vậ gen đƣợ
là 7,8% đối với ậu tương ĐT12 4,3% với giống DT84 (Bảng 3.7).
Bảng 3.7. Kết quả chuyển gen gus vào nách lá mầm đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefacines
Số mẫu thí nghiệm
Tổng số chồ
trên Kan
Số chồ
gus gen (%)
ĐT12 395 114 9 7,8
DT84 480 70 3 4,3
3.23. Hình ảnh kết quả nhuộm X-gluc để kiểm tra b gus
n
; E: cây đậu tương mang gen gus
Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase (gus) đƣợc phân lập từ chủng E.coli RA201. Enzyme β-glucuronidase có khả năng phân hủy cơ chất glucuronidase thành sản phẩm có màu xanh lam dễ nhận biết. Chính những đặc điểm này mà các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các vector chuyển gen để làm chỉ thị dễ nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển (Jefferson và đtg, 1987) [54]. Nhuộm gus thường được thực hiện trong thí nghiệm xác định biểu hiện tạm thời, mô sẹo, chồi mầm và rễ mới tái sinh [121]... Trong thí nghiệm này để khẳng định gen chuyển đƣợc di truyền sang thế hệ sau chúng tôi tiến hành nhuộm phôi của hạt hình thành từ cây chuyển gen ở thế hệ T1. Do vậy các chồi có biểu hiện gen gus tiếp tục đƣợc chuyển sang môi trường ra rễ và sau 2 tuần được chuyển ra bầu trấ
ới (thế hệ T0) và thu hạt để kiểm tra sự có mặt của gen gus trong hạt (thế hệ T1), kết quả cho thấy các hạt đậu tương đều có màu xanh khi nhuộm màu với cơ chất X-Gluc (Hình 3.23). Kết quả biểu hiện thành công gen gus ở hạt đậu tương ở thế hệ T1 là cơ sở để tiến hành thí nghiệm chuyển gen đích biểu hiện ở hạt đậu tương.
Từ các kết quả nghiên cứu chuyển thành công gen gus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84, chúng tôi đã đề xuất quy trình hoàn chỉnh cho việc tái sinh phục vụ chuyển gen đối với cây đậu tương thông qua phương pháp nách lá mầm ở sơ đồ hình 3.24.
Nhƣ vậy, ừ nách lá mầm hạ
2 giống đậu tương ĐT12 ĐT12
ố 3 (0,5 mg/l ) + IAA (0,1
mg/l), môi trường tạo rễ thích hợp khi bổ sung IBA (0,1 mg/l).
Dựa trên tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus tạm thời, cũng nhƣ tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc, bước đầu nhận thấy rằng ĐT12 là giống đậu tương thích hợp với phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm hạt chín.
Donaldson và Simmonds (2000) [43], Olhoft và đtg (2003) [82], Paz và đtg (2006) [90], Zhang và đtg (1999) [153] đã khẳng định kết quả chuyển gen ở cây đậu tương nhờ vi khuẩn A.tumefaciens qua vết thương ở nách lá mầm.
Chúng tôi đã thành công sử dụng dao nhọn để gây tổn thương nách lá mầm đậu tương và lây nhiễm A.tumefaciens tái tổ hợp tạo cây đậu tương chuyển gen. Theo Olhoft và đtg (2001) [84], Xue và đtg (2006) [148], Zhang và đtg (1999) [153] việc gây tổn thương nách lá mầm bằng các vết cắt và kim châm đòi hỏi phải có sự khéo léo, có kỹ thuật để tạo ra đủ mô đích cho sự nhiễm khuẩn. Phương pháp này cũng đã được sử dụng rộng rãi đối với một số giống đậu tương ở Nhật Bản với tỷ lệ chuyển gen đạt từ 0,2% - 10% [152] [89 ].
Tuy nhiên, theo Yamada và đtg (2010) [149 ] nếu sử dụng bàn chải làm từ thép không gỉ để tạo các vết thương ở nách lá mầm thì không yêu cầu nhiều về mặt kỹ thuật và sự khéo léo [149 ] [104]. Mức độ hình thành chồi ở nách lá mầm không chỉ phụ thuộc vào kỹ thuật gây tổn thương mà còn phụ thuộc vào đặc điểm của kiểu gen cây đậu tương.
Hình 3.24. Sơ đồ mô tả quy trình tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương ĐT12
Hạt đậu tương
Khử trùng bề mặt (khí Clo, 16 giờ) Nảy mầm trên GM
Nuôi lỏng tạo huyền phù
Ly tâm thu cặn khuẩn, hoà cặn trong CCM (OD6000,6-1)
Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn Lây nhiễm 30 – 40 phút
Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối
Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 1 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin 50 mg/l)
Cắt bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM (bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l )
Ra rễ trên RM (bổ sung IBA 0,1 mg/l)
4-5 ngày
5 ngày
2 tuần
Ra cây
(giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng)
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens
Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 2 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin75 mg/l )
2 tuần
2 tuần/lần
14-20 ngày