QUA VI KHUẨN A.TUMEFARACIENS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tương ĐT12 và DT84
3.2.1.1. Tối ƣu thời gian khử trùng hạt
Hiện nay có rất nhiều nguyên liệu đƣợc sử dụng cho mục đích tái sinh cây đậu tương phục vụ chuyển gen như: lá mầm non, đỉnh sinh trưởng phôi hạt chín,…. Trong nghiên cứu này, nách lá mầm hạ làm nguyên liệu tái sinh cây thông qua đa chồi. Hạt đậu tương được khử trùng
bằ ờ -
ầm.
Thời gian khử , ảnh hưở
ến khả năng nảy mầm cũng như tỉ lệ mẫu nhiễm trên môi trường nuôi cấy in vitro. Để thu đƣợc nguyên liệu tốt nhất phục vụ cho công việc tái sinh cây đậu tương, thời gian khử trùng cho hạt đậ
các khoảng thời gian 4, 8, 16 và 24 giờ. Kết quả đƣợc đánh giá bằng các chỉ ỉ lệ mẫu nảy mầm, tỉ lệ mẫu nhiễm trên môi trường nảy mầm của hạ ợc trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng nảy mầ Thời gian khử trùng (giờ) Tỉ lệ mẫu nảy mầm (%)
Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)
+ -
4 100 0,00 10,67
8 98,67 1,33 6,67
16 98,67 1,33 2,00
24 52,00 43,33 0,00
Ghi chú: (+) Hạt nảy mầm có màu xanh, thân mầm dài và mập; (-) Hạt nảy mầm có màu vàng, thân mầm ngắn, không có khả năng kéo dài.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian khử trùng khác nhau có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cũng như số lượng lá mầm thu được dùng cho tái sinh. Việc tăng thời gian khử trùng làm giảm số lƣợng mẫu bị nhiễm (mốc và khuẩn) trên môi trường nảy mầm. Cụ thể với 4 thời gian khử trùng khác nhau thì ở 4 giờ tỉ lệ mẫu nhiễm cao nhất là 10,67%, tỉ lệ này giảm dần khi tăng thời gian khử trùng lên 8 giờ (6,67%), 16 giờ (2,00%). Và khi thời gian khử trùng tăng lên đến 24 giờ, tất cả các hạt mang khử trùng đã đƣợc làm sạch hoàn toàn.
Như vậy, nếu chỉ căn cứ vào tỉ lệ mẫu nhiễm trên môi trường GM thì thời gian khử trùng thích hợp là 24 giờ. Tuy nhiên, chất lƣợng lá mầm thu đƣợc có tác động đến khả năng tạo đa chồi của mẫu cấy trong thí nghiệm tiếp theo, những lá mầm có màu xanh đậm, mập đƣợc xem là lựa chọn tối ƣu. Vì vậy, trong thí nghiệm này yếu tố thứ hai đƣợc quan tâm là tỉ lệ hạt nảy mầm đƣợc, cũng nhƣ chất lƣợng mẫu sau nảy mầm. Từ kết quả thu đƣợc chúng tôi nhận thấy rằng tỉ lệ hạt nảy mầm đạt 100% ở các thời gian thí nghiệm là 4, 8 và 16 giờ. Với thời gian thí nghiệm là 24 giờ đã xuất hiện một số hạt không có khả năng nảy mầm (4,67%) và trong số các hạt nảy mầm thì tỉ lệ mẫu có chất lƣợng tốt, sử dụng đƣợc cho tái sinh tạo đa chồi là rất thấp, chỉ đạt 52,00%, trong khi ở các công thức khác là 100% (4 giờ) và 98,67% (8-16 giờ). Nhƣ vậy nhận thấy rằng việc tăng thời gian khử trùng đã có ảnh hưởng ức chế đến khả năng nảy mầm của hạt cũng nhƣ chất lƣợng mẫu thu đƣợc sau nảy mầm (Hình 3.19 ).
Vậy căn cứ vào tỉ lệ mẫu nhiễm và chất lƣợng mẫu sau nảy mầm cho thấy thời gian khử trùng thích hợp cho hạt đậu tương trong nghiên cứu của chúng tôi là 16 giờ. Đây cũng là thời gian chúng tôi sử dụng để khử trùng hạt thu nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
16 giờ 24 giờ
Hình 3.19. Hạt nảy mầm sau các thời gian khử trùng khác nhau
3.2.1.2
Đa số các công trình tái sinh đậu tương sử dụng hai phương pháp chủ yếu là tái sinh qua đa chồi và tái sinh qua phôi soma. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ phương pháp tái sinh qua phôi soma đã được nghiên cứu trên nhiều giống đậu tương khác nhau. Tuy nhiên, quy trình này gặp một số hạn chế đó là: nguồn nguyên liệu khó thu thập, thời gian tái sinh kéo dài (tối thiểu 8 tháng), quy trình tương đối phức tạp.
Phương pháp tái sinh tạo đa chồi có nhiều ưu điểm: chủ động được nguồn nguyên liệu, ít lệ thuộc vào thời vụ, rút ngắn thời gian tạo cây (3 tháng), đồng thời việc khử trùng nguyên liệu cũng đƣợc tiến hành khá đơn giản. Có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen công bố gần đây đã thành công bằng việc sử dụng phương pháp này [82] [83] [89] [97]. Trong phương pháp tái sinh cây thông qua đa chồi, hàm lượng hoocmon sinh trưởng trong môi trường là yếu tố rất quan trọng. Mỗi loại cây đều có một ngưỡng nồng độ thích hợp để có được hiệu quả tạo đa chồi cao nhất. Với đậu tương, hạt chín sau khi khử trùng đƣợc tách thành 2 mẫu giống nhau, mỗi mẫu là một lá mầm liên kết với nách lá mầm và một nửa trụ mầm. Các mẫu này sau khi gây tổn
thương và cắt bỏ đỉnh sinh trưởng, chúng được tạo đa chồi trên 5 loại môi trường (SIM1-SIM5) chứa nồng độ BAP từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l, kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4
Tên giống BAP
(mg/l)
Số mẫu biến nạp
Tỷ lệ mẫu tạo
chồi (%) Số /mẫu
ĐT12
1,0 100 71,6 5,0
1,5 100 76,5 5,5
2,0 100 82,3 6,2
2,5 95 54,1 5,1
DT84
1,0 120 25,4 2,5
1,5 120 41,6 3,4
2,0 120 32,5 3,0
2,5 120 27,4 2,6
Bảng 3.4 cho thấy, đố ĐT12 khi bổ sung 2mg/l BAP vào môi trườ ố chồi trung bình/cụm thu được đạt giá trị cao nhất (82,3% và 6,2 chồi/cụm), trong khi đó vớ 84, tỷ lệ
ạt giá trị cao nhất ở môi trườ 1,5 mg/l BAP (41,6% và 3,4 chồi/cụm), các giá trị này thấp hơn nhiều so với giống ĐT12
ận thấy rằng chất lƣợng chồi củ ĐT12 (Hình 3.20).
Căn cứ vào kết quả trên, chúng tôi lựa chọ
1,5 mg/l BAP để bổ sung vào môi trường tạo đa chồ ĐT12 .
A B
Hình 3.20. Cụm chồi tạo đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy trên SIM (A: DT84, B: ĐT12 )
Ảnh hưởng của GA3 ới khả năng kéo dài chồi
Các cụm chồi tạo trên môi trườ t được chuyể
ờ ổ sung GA3 ới các nồng độ
. Hiệu quả kéo dài chồi đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ mẫu kéo dài chồi và chất lƣợng chồi sau kéo dài (Bảng 3.5 3.5 , khi môi trường chỉ có mặt GA3, tỷ lệ mẫu kéo dài chồi cũng như số chồi kéo dài/cụ
. Tuy nhiên cũng nhận thấy rằng chất lƣợng chồi giảm theo sự tăng nồng độ GA3 bổ sung vào môi trường. Như vậy, căn cứ vào kết quả thu đƣợc trên những nồng độ GA3 nghiên cứ
nồng độ GA3 bổ sung vào môi trường là 0,5 mg/l phù hợp cho việ u tương ĐT12 84 (Hình 3.21).
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của GA3 ến khả năng kéo dài chồi (+++): thân chồi khỏe, phiến lá dày và có màu xanh; (++): thân chồi mảnh, lá mỏng
và có màu lục nhạt; (+): thân chồi nhỏ và yếu có màu vàng, lá mỏng và có màu lục nhạt hơi vàng
A B
Hình 3.21. Cụm chồi trên môi trường kéo dài SEM A- Cụm chồi DT84 ; B- Cụm chồi ĐT12
Trong một số 2
chấ 3 trong môi trường kéo dài chồi
h [83] [90 thí nghiệ ến hành phối
GA3(mg/l) IAA (mg/l)
ĐT12 DT84
Tỷ lệ mẫu kéo dài chồi (%)
Chất lƣợng chồi
Tỷ lệ mẫu kéo dài chồi (%)
Chất lƣợng chồi
0,0 - 24,4 ++ 25,7 ++
0,5 - 76,3 +++ 83,0 +++
1,0 - 75,2 ++ 84,8 +++
1,5 - 75,0 + 85,2 +
0,5 0,1 86,1 ++++ 87,3 ++++
0,5 0,3 86,6 ++ 88,4 +++
0,5 0,5 86,7 + 88,9 +
hợp 2 loạ . Kết quả thu đƣợ ố mẫu kéo dài chồ ự tăng của nồng độ IAA đƣợc bổ sung vào môi trường. Như ất lượng chồi có sự khác biệt khá rõ
giữ ờng có bổ sung 0,3 và 0,5 mg/l IAA có đặc
điểm là nhỏ và yếu, thân, lá có màu lục nhạt ngả vàng. Chất lƣợng chồi tốt nhất thu đƣợc ở công thức có bổ sung 0,1 mg/l IAA, chồi có thân mập, lá to và có màu xanh đặc trƣng, đảm bảo cho việc ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh.
Ảnh hưởng của IBA đế ạo rễ
Bộ rễ ệu quả
ậu tương in vitro
.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ
(+++): rễ trắng, to và có nhiều rễ thứ cấp; (++): rễ có màu vàng, ít rễ thứ cấp; (+):
rễ mảnh, có màu nâu, rất ít rễ thứ cấp
IBA (mg/l)
ĐT12 DT84
Ngày bắt đầu
ra rễ
Số rễ trung bình
Chất lƣợng rễ
Ngày bắt đầu
ra rễ
Số rễ trung bình
Chất lƣợng rễ
0 5 3,2 + 4 4,1 +
0,1 4 5,5 +++ 4 6,5 +++
0,5 3 5,8 ++ 3 7,1 ++
1 3 6,6 ++ 3 7,8 +
Bảng 3.6 cho thấ ắt đầu xuất hiện rễ
u màu trắng, to, dài, nhiều rễ thứ cấp và xuất hiện đều xung quanh gốc câ
ễ sinh trưởng kém, rễ mảnh, có màu nâu sậm, rất ít rễ thứ cấp. Nhƣ vậy, trong những nồng độ IBA chúng tôi đã nghiên cứu nhận thấy 0,1 mg/l là nồng độ thích hợp nhất cho việ ễ cây đậu tương in vitro.
Với những kết quả khảo sát các môi trường tái sinh ở hai giống đậu tương ĐT12 và DT84 so sánh với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác có thể thấy, nồng độ BAP thích hợp đối với sự tái sinh tạo đa chồi của hai giống đậu tương ĐT12 vàDT84 là cao hơn và nồng độ BAP phù hợp của môi trường tạo đa chồi trong nghiên cứu này là 2mg/l, trong khi kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Hường và đtg (2009) [15] là 1,5mg/l BAP và của Rodrigo et al., (2008) [98 ], của Xinping et al., (2006) [147] đều là 1,67 mg/l.
Điều này cho thấy nồng độ BAP trong môi trường tạo đa chồi phụ thuộc vào kiểu gen của mỗi giống đậu tương. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết là các chất kích thích sinh trưởng chỉ có tác dụng ở nồng độ thích hợp và sẽ ức chế các hoạt động thậm chí là gây chết nếu ở nồng độ quá cao. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự phối hợp giữa GA3 (0,5 mg/l) với IAA (0,1 mg/l) là thích hợp cho quá trình kéo dài chồi và với môi trường tạo rễ khi bổ sung nồng độ 0,1 mg/IBA ở giai đoạn ra rễ thu đƣợc chất lƣợng rễ tốt nhất.
Kết quả này cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố, như nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Hường và đtg (2009) [15];
Trần Thị Cúc Hòa (2007) [10]; Rodrigo và đtg (2006) [98]; Rodrigo và đtg (2008) [99]. Tuy nhiên, trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi còn thấy, với
hai chỉ tiêu là tỷ lệ mẫu kéo dài chồi (%) và số chồi kéo dài/cụm có sự sai khác rất ít giữa các công thức thí nghiệm khi bổ sung GA3 và IAA với nồng độ khác nhau. Chính vì vậy cần có những nghiên cứu theo hướng sử dụng riêng rẽ GA3 hoặc IAA ở giai đoạn kéo dài chồi để lựa chọn môi trường kéo dài chồi thích hợp nhất đối trong hệ thống tái sinh ở cây đậu tương.
3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn A.