Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN
3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1
HA là polypeptide gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng một số amino acid đƣợc mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, thuộc loại hình motif riêng biệt, đặc trƣng cho các subtype H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng virus. Đoạn gen HA1 là một chuỗi có kích thước khoảng 1,25kb nằm ở phần đầu gen HA. Các tác giả nghiên cứu về HA cho thấy kháng nguyên HA1 và HA tái tổ hợp đều có mức bảo hộ miễn dịch 100% đối với gà thực nghiệm và đều có thể sử dụng để nghiên cứu sản xuất vaccine tái tổ hợp [4 ].
Gen HA có kích thước tương đối lớn (1,7kb), epitope - yếu tố
quyết định kháng nguyên có - 307-319 và nằm ở
phần đầu gen HA. Chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn 1,7kb
vùng của gen HA chứa epitope có kích thước ngắn hơn gen HA khoảng 0,5kb có kí hiệu HA1op. Trên cơ sở trình tự của đoạn gen HA1 và với mục đích ghép nối đoạn gen HA1 vào vector p201-SLEHP, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu XhoI-HA1 và HindIII-HA1 (Bảng 3.2) để nhân đoạn gen HA1. Cặp mồi đƣợc thiết kế tạo đƣợc mã mở đầu và mã kết thúc cho gen HA1 khi đƣợc nhân lên và có chứa điểm nhận biết của enzyme cắt giới hạn XhoI và Hind III.
Bảng 3.2. Trình tự cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1
Tên mồi Trình tự
XhoI-HA1 5‟ CCGCTCGAGATGGAGAAAATAGTGCTTCT 3‟
HindIII-HA1 5‟ CCCAAGCTTAATGCAAATTCTGCATTGTAAC 3‟
3.1.2.1. Kết quả thiết kế cấu trúc gen HA1
Kết quả nhân gen, tách dòng và đọc trình tự đoạn gen HA1
Chúng tôi đã sử dụng 50ng DNA plasmid tái tổ chứa gen HA cho phản ứng PCR để nhân đoạn gen HA1 với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agrose 0,8% với thang DNA 1kb (Hình 3.13).
Hình 3.13. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen HA1 bằng XhoI-HA1/HindIII-HA1 (M: Thang DNA chuẩn 1kb)
Kết quả ở hình 3.13 cho thấy một đoạn DNA có kích thước khoảng 1,25kb phù hợp với kích thước của đoạn gen HA1 quan tâm đúng theo tính toán lý thuyết và sản phẩm PCR là đặc hiệu và đủ hàm lƣợng cho thí nghiệm tách dòng. Từ kết quả chọn dòng gen và tách plasmide tái tổ hợp mang đoạn gen HA1 và tiến xác định trình tự đoạn gen HA1 trên thiết bị đọc trình tự tự động ABI- 3130 DNA capillary electrophoresis system, kết quả trình bày ở hình 3.14.
Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector p201-SLHEP
Tiến hành thí nghiệm tương tự như thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA, sản phẩm tính sạch đoạn gen HA1 sau đó đƣợc xử lý đồng thời với hai enzym XhoI/Hind III và đƣợc nối vào vector p201-SLHEP. Trên vector có hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển sẽ đƣợc xen vào giữa hai vị trí này. Trên vector còn chứa gen kháng kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi, phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn. Nhờ enzyme các đầu của sản phẩm PCR sẽ đƣợc nối vào vector và plasmid tái tổ hợp p201-SLHEP-HA1 đƣợc tạo thành. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 250C trong 90 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
Plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo ra từ phản ứng ligation sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn. Kết quả thu đƣợc các khuẩn lạc mọc đƣợc trên môi trường chọn lọc và có thể kết luận sơ bộ rằng đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp p201- SLHEP-HA1 vào tế bào E. coli. Để có thể chọn lọc đƣợc những dòng khuẩn lạc mang vector chứa gen HA1 còn nguyên vẹn nhƣ mong muốn, chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid từ những khuẩn lạc này và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn.
Hình 3.14 và trình tự amino acid suy diễn của đoạn gen HA1
Chọn plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt hạn chế
Để khẳng định chắc chắn rằng gen HA1 đã đƣợc gắn vào vector chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt plasmid với enzyme giới hạn XhoI/HindIII.
Theo tính toán lý thuyết, khi cắt bằng 2 enzym giới hạn XhoI/HindIII sẽ thu đƣợc sản phẩm gồm 2 phân đoạn DNA: (i) Đoạn gen HA1 cần chèn vào vector bị cắt ở 2 đầu bởi 2 enzym giới hạn có kích thước khoảng 1,25kb và (ii) Khung vector còn lại sau khi cắt bỏ gen chèn có kích thước khoảng 2,5kb. Sản phẩm phản ứng cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong hình 3.15.
Hình 3.15. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp p201-SLHEP-HA1
Từ kết quả kiểm tra ở hình 3.15 cho thấy 3 trong 4 dòng khuẩn lạc đƣợc kiểm tra đã cho các băng vạch với kích thước như mong muốn. Điều này chứng tỏ rằng đoạn gen HA1 đã đƣợc chèn thành công vào vector p201- SLHEP tạo ra vector tiếp nhận p201-SLHEP-HA1 làm nguyên liệu cho việc thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway®.
Tạo vector chuyển gen mang đoạn gen HA1 bằng kỹ thuật Gateway
Cấu trúc SLEHP - HA1 đã đƣợc thiết kế đƣợc chuyển vào vector pPhaso-dest bằng LR- reation của hệ thống Gateway. Các cấu trúc đều đƣợc kiểm soát bởi promotor đặc trƣng biểu hiện trong hạt phasoline .
Nhƣ vậy để thu đƣợc dòng plasmid pPhaso-SLEHP-HA1 thì hỗn hợp phản ứng LR phải đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh kết quả thu đƣợc một lƣợng khuẩn lạc trên đĩa thạch. Những khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch là những khuẩn lạc có mang plasmid pPhaso-SLEHP-HA1. Do đó, để chọn ra đƣợc những dòng khuẩn lạc nhƣ mong muốn (mang vector chuyển gen) chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony- PCR và sử dụng enzym cắt hạn chế.
Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony -PCR
Chọn 5 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch để tiến hành phản ứng colony- PCR bằng cặp mồi đặc hiệu: XhoI-HA1/HindIII-HA1. Sản phẩm phản ứng đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.16.
3.16. Hình ả chuyển gen mang cấu trúc
pPhaso-SLEHP-HA1
M: Thang DNA chuẩn; 1-5 : Dòng khuẩn lạc; Hàng trên: Kết quả kiể
ới cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1; Hàng dưới: Sản phẩm cắt bởi enzyme Hind III
Kết quả kiểm tra trên hình 3.16 cho thấy với 5 dòng khuẩn lạc đƣợc chọn một cách ngẫu nhiên đều thu được những băng DNA với kích thước như
mong muốn 1,25kb. Điều này chứng tỏ rằng chúng tôi đã biến nạp thành công vector pPhaso-SLEHP- HA1 vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Để khẳng định chắc chắn rằng gen HA1 đã đƣợc gắn vào vector và phản ứng LR đã thành công, chúng tôi tiến hành nuôi lỏng 5 dòng khuẩn lạc nói trên trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng với enzym cắt giới hạ ể
(Hình 3.16 A. tumefaciens
ở bước tiếp theo.
Kết quả biến nạp pPhaso –SLEHP- HA1 vào vi khuẩn Agrobacterium
Chúng tôi sử dụng 50-100ng plasmid pPhaso-SLEHP-HA1 để biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh, ủ đĩa ở 28oC. Sau 2 ngày, kết quả thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc trên đĩa thạch. Để chọn ra những dòng khuẩn lạc nhƣ mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩ ặp
mồi đặc hiệu XhoI-HA1/HindIII-HA1 đƣợc thể hiện trên hình 3.17 cho thấy dòng khuẩn lạc được lựa chọn cho kết quả dương tính với phản ứng PCR với một băng duy nhất có kích thước khoảng 1,25kb. Điều này đã chứng tỏ kết quả biến nạp thành công vector pPhaso-SLEHP-HA1 vào tế bào A.
tumefaciens.
Nhƣ vậy chúng tôi đã tạo đƣợc chủng Agrobacterium mang plasmid tái tổ hợp pPhaso-SLEHP-HA1. Chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang gen chuyển được sử dụng cho biến nạp vào cây thuốc lá và vào cây đậu tương.
3.17. Hình ảnh điện di sản phẩ
58
(M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-3: Dòng khuẩn lạc A. tumefaciens)
Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen HA1
Giống nhƣ việc kiểm tra hoạt động của vector mang gen HA chúng tôi đã tiến hành chuyển cấu trúc vector chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây thuốc lá theo quy trình tái sinh.
ẽ đƣợc trồng trên giá thể thích hợp và tiến hành thu lá để tách DNA và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển. Phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết quả đƣợc thể hiện ở h 3.18. Kết quả ở hình 3.18 cho tất cả các dòng cây chuyển gen đều có kết quả PCR dương tính với cặp mồi đặc hiệu và cho kích thước phù hợp với tính toán lý thuyế 1,25kb.
Nhƣ vậy, bằng việc sử dụng nguồn gen HA của virus H5N1 phân lập ở Việt Nam chúng tôi đã thiết kế thành công vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 biểu hiện trong hạt và tạo đƣợc chủng vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1
mang c gen HA, đoạn gen HA1
1
kb
h 3.18. Kết quả điện di sản phẩ
gen HA1 (M: Thang DNA chuẩn 1kb; (-): Đối chứng âm;WT:
; 1 – 5: Các dòng cây c HA1)
ự
. Chu Hoàng Hà và đtg (2009) 6 đã tạo thành công cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm, virus khảm dƣa chuột (CMV) và virus khảm thuốc lá (TMV), Wang và đtg (2001) tạo cây thuốc lá chuyển gen chứa nhiều kháng nguyên có giá trị 137 . Nguyễn Huy Hoàng và đtg (2010) đã thiết kế đƣợc vector chuyển gen vào thực vật - pK7WG2D/cal/HA1- mang cấu trúc đoạn gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1 bằng kỹ thuật Gateway phục vụ mục đích chuyển gen tạo vaccine thực vật [11]; sự biểu hiện đoạn gen HA1 cũng đƣợc thực hiện thành công trên cây bèo tấm (Trần Thị Phương Liên và đtg, 2009) [18]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kết quả thiết kế thành công vector biểu hiện đặc trƣng ở hạt, đƣợc chuyển vào cây thuốc lá và xác định đƣợc dòng thuốc lá chuyển gen mang gen HA, đoạn gen HA1 đã khẳng định cơ sở khoa học của việc sử dụng giống thuốc lá K326 làm cây mô hình trước khi thực hiện thí nghiệm chuyển gen vào cây mục tiêu.
1,25kb