2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen
Phản ứng PCR khuếch đạ ừ ầu đƣợc
tiến hành với thành phần và chu kỳ nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 Nước cất khử ion, khử trùng 31,25 (NH+4) 10X 5 3 MgCl2 (25mM) 5 4 dNTPs (10mM) 4 5 Primer1 (10pmol/ àl) 2 6 Primer2 (10pmol/ àl) 2 7 Taq polymerase 5 đơn vị/ àl 0,25 8 ADN khuụn(10-20ng/ àl) 0,5 Tổng 50
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 30 giây 3 Gắn mồi 54 1 phút 20 4 Kéo dài chuỗi 72 45 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.1.2. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agrose
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% và cắt lấy băng quan tâm.
Sau đó gel đƣợc làm sạch (thôi gel) theo bộ kit AccuPrep® Gel Purification Kit (Bioneer):
Cõn gel theo quy ước : 1 mg tương đương với 1àl.
Bổ sung dịch GB theo tỉ lệ : Vmóu : VGB = 1 : 5 (àl).
Ủ ở 60oC trong 10 phút, 2 phút đảo nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 2 phút cho gel tan hoàn toàn.
Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
Bổ sung 500 àl GB, ly tõm 13000 v/p trong 1 phỳt. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
Bổ sung 500 àl WB, ly tõm 13000 v/p trong 1 phỳt. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
Thờm 500 àl WB để rửa sạch sản phẩm, ly tõm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết dung dịch WB.
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml.
Hũa tan DNA trong 30 - 50 àl nước khử ion, khử trựng hoặc dung dịch EL, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó li tâm 13000 v/p trong 1 phút. Thu lấ
ịch.
2.2.1.3. Phản ứng ghép nối
phản ứng nhƣ sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng ghép nối
Thành phần Thể tớch (àl)
(~200 ng)
PCR (NH+4) 10X Nước cất đề ion khử trùng
Vector
0,5 – 4 1
Thêm nước đến thể tích bằng 5 1
Tổng thể tích 6
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22 - 23oC). Đặt phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả E. coli
(1972).
2.2.1.4.
-co . Sử dụng kit Plasmid
Extraction Kit và chỉ dẫn của nhà sản suất để tách chiết plasmid đối với những khuẩn lạc có sản phẩm colony-PCR như mong muốn. Đây là phương pháp tách plasmid với số lƣợng lớn từ 2-5 ml dịch khuẩn E. coli, có số bản sao plasmid cao. Hoá chất sử dụng tách plasmid thể hiện ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần hóa chất tách plasmid
Ký hiệu Thành phần
Sol I Glucose (50 mM), Tris HCl ( 25 mM ) pH 8, ETDA (10 mM) pH8 Sol II 0.2 NaOH, SDS 1%
Sol III 60 ml CH3COOK (5M) 11,5 ml CH3COOH 28,5 ml H20 Quy trình tách plasmid:
Hút 2 ml dịch khuẩn E. coli đã nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng cho vào ống eppendorf 2 ml. Ly tâm 10000 v/p trong 5 phút để thu tế bào.
Cho 250 àl buffer RS để hũa tan tế bào. Chắc chắn rằng RNase đó đƣợc bổ sung vào buffer RS. Bổ sung 250 àl BL Buffer và mix nhẹ bằng tay, ủ ở nhiệt độ phòng 1 - 1,5 phút, không đƣợc vortex vì sẽ làm lẫn plasmid với genome.
Bổ sung 350 àl NE buffer và mix ngay lập tức bằng cỏch đảo ống 3 - 4 lần. Tránh kết tủa cục bộ, đảo đều dung dịch nhẹ nhàng nhƣng liên tục ngay sau khi bổ sung buffer NE. Dung dịch trở nên có màu trắng sữa.
Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Hút dịch nổi và cho vào cột Plasmid Extraction Kit. Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
Bổ sung 500 àl DE vào cột đợi 5 phỳt, ly tõm 13000 v/p trong 1 phỳt, loại bỏ dịch chảy qua cột.
Bổ sung 500 àl WB vào cột, ly tõm 13000 v/p trong 1 phỳt, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết dung dịch WB.
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml.
Hũa tan DNA plasmid bằng cỏch bổ sung 50 - 100 àl EL hoặc nước cất khử ion, khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó li tâm 13000 v/p trong 1 phút. Lấy dịch.
Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch plasmid trên gel agarose 0,8%.
2.2.1.5. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway i) Phản ứng LR:
Bổ sung các thành phần sau vào ống ly tâm 1,5 ml ở nhiệt độ phòng và đảo nhẹ:
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng LR
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 Plasmid pENTR (50 – 150 ng) 1
2 Vector pPhaso- dest (150 ng/l) 0,5
3 Nước khử ion, khử trùng 2,5
Tổng 4
Làm tan hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM trên đá khoảng 2 phút. Vortex 2 lần, mỗi lần khoảng 2 giây.
Bổ sung vào ống ly tõm 2 àl enzyme LR ClonaseTM để phản ứng và đảo bằng cách vortex nhẹ nhàng 2 lần. Ly tâm nhẹ nhàng. Ủ phản ứng ở 25oC trong 1 giờ.
Bổ sung 1 àl dung dịch proteinase K để kết thỳc phản ứng. Đảo nhẹ, ủ ở 37oC trong 10 phút.
ii) Biến nạp:
Chuyển 3 àl phản ứng LR vào 50 àl tế bào E. coli One Shotđ TOP 10.
Ủ trong đá 30 phút. Shock nhiệt tế bào ở 42oC trong 45 giây.
Bổ sung 250 àl S.O.C. Ủ ở 37oC trong 1 giờ bằng mỏy lắc.
Chuyển 50 - 250 àl vào cỏc đĩa chọn lọc chứa khỏng sinh streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 mg/l và chloramphenicol 100mg/l.
iii) Chọn dòng bằng phản ứng cắt enzyme hạn chế và PCR:
Chọn vài khuẩn lạc nuôi qua đêm 37oC trong 4ml LB lỏng có bổ
ể tách chiết plasmid. Sau đó, thực hiện phản ứng cắt
plasmid bằng .
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế
STT Thành phần Thể tích ( l)
1 PCR (NH+4) 10X 2
2 Enzyme 1 1
3 Enzyme 2 1
4 H2O 1
5 Plasmid 5
Tổng 10
Bổ sung lần lƣợt các thành phần trên vào ống eppendorf 1,5 ml, ủ ở 37oC trong 2 giờ.
Lựa chọn những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng RE để chọn dòng bằng phản ứng PCR với các cặp mồ .
2.2.1.6. Biến nạ ế bào A. tumefaciens
Nuôi cấy tế bào vi khuẩn trên các môi trường được trình bày ở Bảng 2.7.
Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens
Làm mới chủng trên môi trường LB đặc. Nuôi lắc một khuẩn lạc trong 2ml môi trường LB lỏng ở 28oC trong 6 giờ.
Lấy 100 l dung dịch vi khuẩn nuôi cấy tiếp ở 28oC qua đêm trong 100ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc đến khi OD600nm = 1 - 1,5.
Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5.000 vòng/phút trong 20 phút để thu cặn tế bào. Rửa cặn hai lần trong 10ml 1mM HEPES (N-2- hydroxyethylpiperazine-N‟-2-ethanesulfonic acid) pH 7,0.
Cặn tế bào hoà tan trong 500-700 l 10% glycerol. Chia 45 l dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ chủng ở -85oC.
Khi đã có đƣợc tế bào khả biến A. tumefaciens, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào bằng phương pháp xung điện:
Bảng 2.7. Thành phần môi trường nuôi khuẩn
Môi trường Thành phần
YEP đặc yeast extract (10 g/l) + NaCl (5 g/l) + tryptone ( 10 g/l) + agar (15 g/l), pH = 7
YEP lỏng yeast extract (10 g/l )+ NaCl (5 g/l) + tryptone(10 g/l), pH = 7 LB đặc yeast extract (5 g/l )+ NaCl (10 g/l) + tryptone (10 g/l )+ agar
(15 g/l), pH = 7
LB lỏng yeast extract (5 g/l )+ NaCl (10 g/l) + tryptone (10 g/l), pH = 7
Biến nạ :
Tế bào khả biến đặt trong đá 5 phút. Bổ
tế bào khả biến và đảo nhẹ. Rửa Cuvette bằng cồn 100o, rửa lại bằng nước khử ion, khử trùng rồi thấm khô.
Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens + vào cuvette.
Xung điện: 2.5 kv, 25àF và điện trở 400. Đặt ngay vào đỏ. Sau 5 phỳt bổ sung 1 ml YEB (hoặc LB lỏng) và đảo nhẹ.
Chuyển sang ống eppendorft 2 ml. Ủ ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc.
Chuyển 300 àl vào cỏc đĩa chọn lọc chứa khỏng sinh streptomycine 40 mg/l, spectinomycine 100 mg/l và rifamycin 50 mg/l. Ủ ở 28oC từ 24 - 48 giờ.