QUA VI KHUẨN A.TUMEFARACIENS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN ĐOẠN GEN HA1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
3.3.2. Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T 1
Sử dụng lá non của 8 dòng cây đậu tương chuyển gen theo dõi ở thế hệ T1 để tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen HA1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả trong 8 dòng cây phân tích ở thế hệ T1 chỉ có 2 dòng cây cho hạt là H11 và H4 (T2). Thu mẫu lá của hai dòng đậu tương chuyển gen H11 và H4 để tách chiết DNA, kiểm tra đoạn gen HA1 bằng PCR với cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1, kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen chuyển HA1 đƣợc trình bày ở hình 3.28.
Hình 3.28 cho thấy dòng đậu tương chuyển gen H11 có kết quả dương tính với phản ứng PCR, sản phẩm PCR là đoạn DNA có kích thước đúng với kích thước gen HA1 (1,25kb). Như vậy có thể khẳng định đoạn gen HA1 đã được biến nạp thành công vào cây đậu tương và được di truyền từ thế hệ T0
đến thế hệ T1 và T2 (3 thế hệ). Đối với dòng đậu tương chuyển gen H4 chúng tôi chƣa thu đƣợc kết quả về sự có mặt của đoạn gen HA1 ở thế hệ T2 nhƣ mong muốn, rất có thể nhiều khả năng đoạn gen HA1 đã không còn tồn tại trong hệ gen của dòng đậu tương H4 ở thế hệ T2. Do vậy cần có những nghiên cứu tiếp theo làm sáng tỏ nhận xét này.
Tiếp cận phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây đậu tương chuyển gen bằng phản ứng PCR đã đƣợc các tác giả tiến hành [15], [22], tuy nhiên, để xác định đƣợc số bản copy trong cây chuyển gen, một số tác giả cho rằng sử dụng phương pháp Southenrt blot có độ tin cậy và thông dụng hơn trong phân tích cây chuyển gen [3 ] [109].
Hình 3.28. Phân tích sản phẩm PCR bằng cặp mồi đặc hiệu XhoI-HA1/
HindIII-HA1 với các dòng cây đậu tương thế hệ T1
M: Marker, (-) đối chứng âm, (wt) cây không chuyển gen, H4, H11: hai dòng đậu tương cần phân tích ở thế hệ T1)
Kết quả phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp ở hạt của cây đậu tương chuyển gen
Từ kết quả chọn dòng đậu tương chuyển gen H11 dương tính với phản ứng PCR ở thế hệ T2, chúng tôi sử dụng hạt của dòng H11 (T2) để phân tích protein tái tổ hợp HA1. Protein tổng số đƣợc chiết rút từ hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11 ở thế hệ T2 được phân tích bằng phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide và kiểm tra với kháng thể c-myc bằng kỹ thuật lai Western blot, kết quả lai Western blot đƣợc trình bày ở hình 3.29.
Hình 3.29. Hình ảnh protein HA1 hiện phim đƣợc phân tích bằng Western blot từ protein tổng số chiết từ hạt của dòng đậu tương
chuyển gen H11
(M: Thang protein chuẩn; (-): cây không chuyển gen; 1-2: các mẫu hạt thu được của cây đậu tương H11)
Kết quả phân tích Western blot ở hình 3.29 cho thấy protein HA1 đƣợc phát hiện ở kích thước khoảng 40kDa, tương ứng với kích thước của protein HA1 theo tính toán lý thuyết. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Lê Văn Sơn về kết quả biểu hiện đoạn gen HA1 trên cây Arabidopsis [23] và nghiên cứu biểu hiện đoạn gen HA1 của Bruchmüller và đtg (2007) ở hạt lúa mạch phục vụ nghiên cứu vaccine thực vật [33 ]. Từ kết quả lai Western chúng tôi đã dự đoán protein tái tổ hợp HA1 biểu hiện trong hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11 có hàm lượng thấp, tuy nhiên, chúng tôi chƣa định lƣợng đƣợc loại protein tái tổ hợp HA1 này, vì thế cần phải có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp HA1 trên hạt đậu tương chuyển gen. Trong thực tế để có đủ nguồn vật liệu phục vụ đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm cần có những nghiên cứu nhằm tăng cường sự biểu hiện của gen HA1
trong hạt với mục đích thu đƣợc protein tái tổ hợp có hàm lƣợng cao. Protein tái tổ hợp sử dụng trong vaccine thực vật là phải có tính kháng nguyên giống với tính kháng nguyên của protein tự nhiên. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tạo đƣợc vector chuyển gen mang gen HA và vector chuyển gen mang đoạn gen HA1, đồng thời đã đánh giá hoạt động của 2 vector này trên cây thuốc lá, thu được các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0, T1 và T2. Bước đầu biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11 nhƣ vậy gen chuyển HA1 đã đƣợc di truyền từ thế hệ T0, T1
và T2 và đƣợc biểu hiện thành công ở thế hệ T2. Đây sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong chiến lƣợc sản xuất vaccine ăn đƣợc từ hạt đậu tương chuyển gen nhằm góp phần phòng chống bệnh cúm A do virus H5N1 gây ra ở người và động vật.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1. Thiết kế thành công hai cấu trúc vector tái tổ hợp mang gen HA, đoạn gen HA1 biểu hiện trong hạt và tạo đƣợc chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen HA và HA1 của virus cúm A/H5N1.
1.2. các dòng c gen HA,
đoạn gen HA1. T
1,7 kb (đối với dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pPhaso- SLEHP-HA) và 1,25kb (đối với dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pPhaso-SLEHP-HA1).
2 giống đậu tương ĐT12
(2 mg/l) ở giống ĐT12
3 (0,5 mg/l )+ IAA (0,1 mg/l), môi trường tạo rễ thích hợp khi bổ sung IBA (0,1 mg/l).
ĐT12
gus.Tỷ lệ cây mang gen biến nạp đƣợc kiểm tra ở gia
7,8 ĐT12 4,3 % với giống DT84.
1.5. Đã chuyển thành công cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương ĐT12 và thu được 8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T0 dương tính với phản ứng PCR, phân tích cây đậu tương ở thế hệ T1và T2 đã xác định được sự di truyền của gen chuyển HA1 qua 3 thế hệ T0, T1 và T2. Ở thế hệ T1 đã thu đƣợc dòng đậu
tương H11 mang đoạn gen HA1 và biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 trong hạt của dòng đậu tương chuyển gen này.
2. ĐỀ NGHỊ
2.1. Tiếp tục chọn lọc, phân tích biểu hiện protein HA1 ở hạt củ đậu tương biến nạp ở các thế hệ tiếp theo.
2.2. Cần k ủa protein tái tổ hợp
thí nghiệm.
CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyễn Thu Hiền, Lê văn Sơn,Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2009),
“Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên bề mặt cúm A/H5N1 trong thực vật”, Báo cáo khoa học hội nghị Công nghệ sinh học Toàn quốc năm 2009, tr.122-126.
2. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê văn Sơn (2011),
“Nghiên cứu khả năng tái sinh và biến nạp gen qua nách lá mầm của hai giống đậu tương (Glycine max L.) ĐT12 và DT84 bằng Agrobacterium”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8( 38): tr. 1305-1310.
3. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2012),
“Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của virus H5N1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật”, Tạp chí khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên, 89(1):tr. 123-127.
4. Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2013), “ Biểu hiện kháng nguyên của virus H5N1 trong thực vật”, Tạp chí Y học Việt nam, tập 411: tr 219-224.