1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT
1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật
Dựa trên cơ sở khoa học trên, việc gắn một hay nhiều gen kháng nguyên làm vaccine động vật và người vào hệ thống Ti-plasmid và A. tumefaciens đã đƣợc thực hiện. Sau khi chuyển gen, thực vật thế hệ mới đã tiếp nhận một nguồn gen làm vaccine từ vi sinh vật hoặc nguồn sản xuất protein có hoạt tính sinh học nào đó. Khi đƣợc canh tác, cây mang gen kháng nguyên đã tiến hành sản xuất sản phẩm và chứa trong các thành phần cơ thể chúng. Nếu tách chiết và tinh sạch chúng sẽ thu đƣợc sản phẩm protein kháng nguyên. Nếu sử dụng nguyên vẹn, động vật và người “ăn” loại thực vật này thì về nguyên tắc, sẽ tiếp nhận đƣợc nguồn vaccine và do vậy có đƣợc khả năng miễn dịch [107].
Ƣu thế của thực vật chuyển gen để sản xuất vaccine và các hợp chất có hoạt tính sinh học cao là chúng dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, sản lượng cao, do vậy cho chúng ta thu đƣợc một lƣợng sản phẩm lớn [112] . Những kháng nguyên đƣợc sản xuất trong thực vật không mang nguồn bệnh đến cho con người, những độc tố trong hệ thống vaccine được giảm thiểu vì những tác nhân gây bệnh cho người và động vật không gây bệnh trên thực vật [113 ].
Khi phát triển vaccine thực vật cần quan tâm đến ba vấn đề quan trọng là: (1) Phải lựa chọn loại thực vật nào để dễ dàng thao tác đƣa gen vaccine vào, lại vừa ngon miệng để con người và động vật ăn chúng. Sự lựa chọn thực
vật để sản xuất và phát triển vaccine là rất quan trọng; (2) Nên chọn loại gen kháng nguyên nào ghép vào hệ gen thực vật, để sau khi chuyển vào cơ thể, chúng không bị enzyme của hệ tiêu hóa phân hủy, đảm bảo còn tồn tại để kích thích miễn dịch. Trở ngại chính của việc sử dụng vaccine thực vật là phải tìm cách khắc phục sự phân giải của protein trong môi trường ruột. Kết quả nghiên cứu cho thấy, vaccine gây đáp ứng miễn dịch bằng đường miệng đòi hỏi một liều dùng phải cao hơn vaccine tái tổ hợp do một phần kháng nguyên bị mất tác dụng trong môi trường acid của dạ dày [69]; (3) Nếu dùng thực vật chuyển gen để sản xuất kháng nguyên làm vaccine thì phải chọn cây dễ trồng, năng suất cao, dễ dàng thu hoạch, chế biến và bảo quản.
Một trong những loài thực vật đƣợc chọn đầu tiên để chuyển gen vaccine là cây thuốc lá, vì loại cây này dễ thao tác bằng kỹ thuật gen, dễ dàng nhân giống và dễ trồng. Năm 1992, Mason và đtg đã thực hiện chuyển gen kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B vào đối tƣợng này [70]. Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen thành công nhƣ chuyển gen kháng nguyên cholera phòng bệnh dịch tả, gen kháng nguyên phòng bệnh than, gen BfpA phòng bệnh đường ruột do enteropathogenic E.coli (EPEC) gây ra [55], gen kháng nguyên phòng bệnh uốn ván và nhiều bệnh khác. Tuy nhiên, loại cây này không được người và động vật thích ăn, vả lại chúng rất độc nên chúng chỉ đƣợc dùng vào mục đích nghiên cứu, hoặc sản xuất chế phẩm sinh học bằng công nghệ gen.
Khoai tây và các loại cây ăn quả đang là mục tiêu đƣợc chọn để chuyển gen vaccine, vì nó vừa là thức ăn của người và động vật, vừa có thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao nên giá thành rẻ và dễ sử dụng [139]. Các công trình nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây đã cho kết quả khả quan nhƣ chuyển gen kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B [55], gen LTB, gen
phòng bệnh human papillomavirus-like particles [69] và gen kháng nguyên bề mặt vỏ HIV-1 gp120 [70].
Mason (1998) và Lauterslager (2001) 62 [69] đã chuyển gen LTB phòng bệnh đường ruột do E. coli vào khoai tây, khi thử nghiệm trên động vật đã chứng minh đƣợc trong cơ thể đã sinh ra kháng thể trung hòa độc tố của E.
Coli . Năm 2004, Tacket và đtg đã chuyển gen kháng nguyên LTB tái tổ hợp vào các cây ngũ cốc để tạo ra vaccine cho con người 114 . Tính khả thi của vaccine thực vật đã đƣợc chứng minh, 1 mg sản phẩm protein LTB trong cây ngũ cốc hòa với đệm cho động vật ăn thì có 78% động vật thí nghiệm tạo ra kháng thể IgG kháng lại bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra (trong huyết thanh), 44% phát triển kháng thể IgA [114]. Kang và đtg (2004) đã cải thiện mức độ biểu hiện của gen kháng nguyên độc tố E. coli ở lục lạp cây thuốc lá bằng cách thay serine thành lysine tại điểm 63 trên tiểu phần A (LTK63), kết quả đã tăng lƣợng protein LTK63 ở lục lạp cây thuốc lá lên xấp xỉ 3,7% protein hòa tan tổng số. LTK63 trong tế bào cây thuốc lá có thể đƣợc sử dụng nhƣ một tá dƣợc để phát triển thành vaccine phòng bệnh tiêu chảy. Viêm gan B là một bệnh truyền nhiễm mãn tính do virus viêm gan B gây ra.
HBsAg (hepatitis B surface antigen) là protein kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B, khi hiện diện trong cơ thể nó sẽ kích thích hệ miễn dịch sinh kháng thể chống lại virus viêm gan B. Hiện nay, người ta đã sản xuất vaccine DNA tái tổ hợp HBsAg trong nấm men hoặc vi khuẩn, tuy nhiên việc thu vaccine theo phương pháp này rất tốn kém và công phu. Vì thế, một dạng vaccine mới đã ra đời đó là vaccine thực vật với giá thành rẻ được hướng đến phục vụ cho các nước nghèo, nơi mà dịch bệnh viêm gan B đang bùng phát và lây lan mạnh [119] [120].
Mason (1992) lần đầu tiên đã chuyển gen kháng nguyên bề mặt viêm gan B vào cây thuốc lá [70]. Kapusta và đtg (1999) cũng đã tạo ra cây đậu
lupin và cây rau diếp có chứa kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg) [ 55]. Các thí nghiệm trên chuột sau đó cho thấy cơ thể đã có khả năng đáp ứng miễn dịch ở mức độ cao. Với những người tình nguyện đã ăn những cây rau diếp chuyển gen, trong máu cũng đã có phản ứng trả lời.
Khandelwal và đtg (2003) 57 , đã sản xuất ra hemagglutinin protein trong cây thuốc lá để sản xuất loại vaccine phòng bệnh do virus rinderpest gây ra ở gia súc, vaccine này đã đƣợc thử nghiệm trên chuột cho đáp ứng miễn dịch cao. Bệnh sởi là căn bệnh truyền nhiễm do virus, nguyên nhân chính là do sự lây lan của Paramyxovirus trong không khí. Gần đây, các nhà khoa học đã tạo ra protein kháng nguyên bệnh sởi trong cây thuốc lá, khoai tây, lúa, rau diếp, chuối và cà rốt [140] [141]. Các thí nghiệm kiểm tra huyết thanh lấy từ các loại động vật ăn cây chuối chuyển gen cho thấy trong huyết thanh của chúng có chứa các kháng nguyên hemagglutinin protein [135]. Bệnh tiêu chảy ở lợn (PEDV- porcine epidemic diarrhea virus) đã làm chết hàng loạt đàn lợn và gây tổn thất kinh tế rất lớn, vì vậy việc phát triển vaccine phòng bệnh là rất quan trọng. Xuất phát từ những yêu cầu đó, Bae và đtg (2003) 28 đã tạo ra cây thuốc lá chuyển gen có chứa protein kháng nguyên trung hòa độc tố PEDV.
Kết quả thử nghiệm cho thấy khi lợn ăn cây chuyển gen này trong cơ thể của chúng đã có phản ứng miễn dịch chống lại độc tố của mầm bệnh.
Thời gian gần đây ở Việt Nam, hướng nghiên cứu vaccine thực vật cũng đã bắt đầu đƣợc một số phòng thí nghiệm tiếp cận [122]. Chẳng hạn nhƣ:
chuyển gen kháng nguyên của virus dại vào cây lạc, chuyển gen kháng nguyên cholera toxin B subunit (CTB) của vi khuẩn Vibrio cholerae vào cây mía [17], chuyển gen kháng nguyên của virus viêm gan B vào cây cà chua và thuốc lá, phát triển vaccine thực vật cho bệnh cúm gia cầm [11] [14], biểu hiện kháng nguyên virus H5N1 trong hạt cây Arabidopsis [23 ].
Hemagglutinin với nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật
Vấn đề biểu hiện và sản xuất kháng nguyên HA ở lƣợng đáng kể đƣợc quan tâm nghiên cứu từ năm 2002 trở lại đây. Nhiều loại protein, enzyme và kháng nguyên đã biểu hiện thành công trong tế bào vi sinh vật và nhiều trong số đó đã đƣợc áp dụng rộng rãi trong thực tế cuộc sống nhƣ dùng làm thuốc, thực phẩm chức năng…Kháng nguyên HA cũng nhƣ các tiểu phần HA1, HA2 của một số virus cúm A nhƣ H1N1, H3N2, H7N9 và H5N1 đã đƣợc nghiên cứu biểu hiện trong tế bào vi sinh vật nhƣ E.coli, Baculorvirus, nấm men P.
pastoris và S. cerevisiiae. Việc biểu hiện gen này trong thực vật đang đƣợc tiến hành nghiên cứu, tuy nhiên, có những kết quả trái ngƣợc nhau đƣợc công bố.
Spitsin và đtg, (2009) thử biểu hiện HA, HA1 từ chủng A/Vienam/1203/2004 vào thuốc lá nhƣng kết quả lai miễn dịch cho thấy chƣa biểu hiện thành công.
Trong khi đó, Shoji năm 2009, đã biểu hiện thành công gen HA từ chủng A/Indonesia/05/05 sử dụng vector pGRD4. Những nghiên cứu của D‟Aoust năm 2008 37 , đã biểu hiện đƣợc gen Hemagglutinin (HA) từ virus H5N1 (A/Indonesia/5/05) và H1N1 (A/New Caledonia/20/99) tạm thời trong cây thuốc lá Nicotiana.bethamiana. Biểu hiện lƣợng lớn HA tích tụ trong dạng hạt (virus like particles) vùng giữa các tế bào (apoplastic) ở cây thuốc lá cho hiệu suất đến 50mg/kg [37]. Nghiên cứu của Bruchmüller và đtg (2007) 33 cho thấy HA1 đã cải biến mã codon thích hợp với thực vật đƣợc biểu hiện cao của trong cây đại mạch dưới sự điều khiển của promoter gliadin lúa mỳ. Phân tích bằng Western blot khẳng định sự biểu hiện của HA1 trong hạt của 84 dòng chuyển gen HA1 [33]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu biểu hiện gen HA đang được tiến hành trên đối tượng thực vật như cây đậu tương và đã thành công trong việc biểu hiện gen HA trên cây thuốc lá [22] [23]. Tạo vaccine thực vật là một hướng đi cần thiết nhưng cho đến nay vẫn chưa có vaccine thực vật mang gen HA đƣợc đƣa vào sử dụng. Mặc dù kết quả nghiên cứu còn khiêm tốn, nhưng đầy hứa hẹn trong tương lai sẽ có nhiều mô hình vaccine thực vật phòng bệnh cho người và vật nuôi sẽ được phát triển ở Việt Nam.