2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in
Các môi trường đều được chuẩn pH = 5.8 và khử trùng (Bảng 2.8). Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 20C, cường độ chiếu sáng 30-40 Em- 2s-1, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ ngày.
Bảng 2.8. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy in vitro Loại môi trường Kí hiệu Thành phần
Nảy mầm hạt (Germination medium)
GM Muối B5 (3,052 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,8
Bổ sung: vitamin B5(1 mg/l) Đồng nuôi cấy
(Co-cultivation medium)
CCM Muối B5 (0,316 g/l)+ MES (3,9 g/l) + sucrose (30g/l )+ agar (5 g/l), pH = 5,4
Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ AS (0,2 mM) + L-cysteine (400 mg/l) + Sodium thiosulfate (158 mg/l) + DTT (154 mg/l )+ GA3(0,25 mg/l) + BAP Cảm ứng tạo đa
chồi (Shoot induction medium)
SIM Muối B5(3,052 g/l) + MES (0,59 g/l) + sucrose (30 g/l), pH = 5,6
Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ BAP
Kéo dài chồi (Shoot elongation medium)
SEM MS (4,3 g/l) + MES( 0,59 g/l )+ sucrose (30 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6
Bổ sung: vitamin B5 1 mg/l + L-asparagine (50 mg/l) + L-pyroglutamic acid (100 mg/l )+ IAA + GA3
Ra rễ (Rooting medium)
RM MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6
Bổ sung: IBA + vitamin B5 (1 mg/l )
2.2.2.1. Kỹ thuật tạo cây thuốc lá chuyển gen
Tái sinh đa chồi và chuyển gen: Sau 2-3 tuần cây con phát triển 3-4 lá thật thì có thể tiến hành nuôi cấy. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1cm2 và đặt lên môi trường tái sinh GM (MS + sucrose 30g/l + Agar 8
g/l + BAP1 mg/l). Các mảnh lá này cũng là đối tƣợng cho chuyển gen. Sau hai ngày trên môi trường GM, mảnh lá sẽ được ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn có chứa vector chuyển gen mang gen quan tâm. Sau 10 phút, các mảnh lá sẽ được đồng nuôi cấy với vi khuẩn trên môi trường GM (BAP 1 mg/l) 2 ngày. Sau đó, các mảnh lá tiếp tục được chuyển lên môi trường GM (1mg/l BAP) để tái sinh. Sau 4-5 tuần các cụm chồi hình thành tiếp tục đƣợc cắt chuyển sang môi trường GM mới có chứa kháng sinh chọn lọc kânmycine 50.
Ra rễ: Sau 4-5 tuần các chồi phát triển cao khoảng 2-3 cm thì đƣợc cắt và chuyển sang môi trường ra rễ RM (MS + sucrose 30g/l + Aga 8g/l) có chứa kháng sinh chọn lọc và IBA (1 mg/l).
Ra bầu và nhà lưới: Sau 3 - 4 tuần cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh với 3-4 lá thật sẵn sàng cho ra bầu trấu: cát (1:1). Cây phát triển với 4-5 lá thật thì chuyển ra trồng trong bầu 40% đất, 30% trấu hun hoặc mùn mục và 30%
phân chuồng mục được trộn đều và xử lý sạch bệnh dưới điều kiện nhà kính.
2.2.2.2. Kỹ thuật tái sinh cây đ và chuyển gen ở đậu tương
Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín được tiến hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001) có cải tiến [82]. Các bước thực hiện diễn ra theo sơ đồ h 2.4. Thành phần các loại môi trường sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín được chỉ ra trong bảng 2.8.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 2000lux.
Hình 2.2. Sơ đồ ậu tương
Tạo nguyên liệ ảm ứng tạo đa chồi
Hạt đậu tương được loại bỏ các hạt kém chất lượng và tiến hành khử trùng bằng khí clo tr ủ . Sau khi khử trùng, cho hạt nảy mầm trên môi trường GM, sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm, tách đôi hai lá mầm, loại đỉnh sinh trưởng. Phần lá mầm còn lại được đặt lên môi trường cảm ứng tạo đa chồi (SIM). Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung
Hạt đậu tương
Khử trùng bề mặt
Nảy mầm
A. tumefaciens/gen
Nuôi lỏng khuẩn
Tạo huyền phù khuẩn Gây tổn thương, lây nhiễm
Cảm ứng tạo đa chồi
Kéo dài chồi
Ra rễ
Ra cây
bình /cụm sau thời gian cảm ứng là 4 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống đậu tương cũng như mức độ phù hợp của môi trường.
Kéo dài chồ ỉnh
Các cụm chồi được tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trường SIM được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài của chồi sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm nuôi cấy cũng nhƣ chất lƣợng chồi.
Khi các chồi đạt chiều cao từ 4-5 cm, chọn những chồi khỏe chuyển sang môi trường ra rễ RM. Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây đƣợc lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây đƣợc đặt trên giá thể ra cây. Cây sống sót trên giá thể đƣợc đƣa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới.
Chuyển gen vào nách lá mầm hạt chín
Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Olhoft và cộng sự (2001) có cải tiến [82]. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen đƣợc mô tả tổng quát trong hình 2.4.
Hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần lá mầm (tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào phần
nách lá mầm. Lá mầ ổ ễm khuẩn Agrobacterium
.
Mẫu đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1 trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu đƣợc chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được lắc trong môi trườ (SIM) có bổ sung cefotaxim 500 mg/l với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt bỏ chồi chính trên các mảnh lá mầ ấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung cefotaxim 500 mg/l. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc
có bổ sung cefotaxim 500 mg/l .
, các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường phát triển chồi (SEM) có bổ sung cefotaxim 500 mg/l . Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) có bổ sung cefotaxim 250 mg/l để tạo cây hoàn chỉnh.
gus Jefferson
(1987) [54]: Các mảnh lá đƣợc nhuộm với dung dịch 5-bromo-4-chloro-3- indolyl glucoronide (X-gluc) 8-10 giờ trong tối ở nhiệt độ 370C, sau đó rửa bằng cồn 70% và quan sát dưới kính hiển vi. Những vùng có gen gus nhuộm màu xanh lam.
HA .
2.2.3. P chuyển gen
2.2.3.1. Kỹ thuật PCR DNA hệ gen
Edwards et al.(1991)[46]
400 àl .
300 àl 100 àl H2O. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với thành phần đƣợc trình bày trong bảng 2. 1 và chu kỳ nhiệt
trong bảng 2.2. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi đƣợc xác định dựa trên nhiệt độ bắt mồi của cặp mồi đã đƣợc thiết kế.
2.2.3.2.
ậu tương -
sung NaCl (150 mM), EDTA (5 mM), SDS 0.1% -mercaptoethanol
(0.1%) . Thu
-
- ).
2.2.3.3. Western blot
(1970) [60]
nitrocellulose HybondTM (Amersham)
-
ALP h kháng thể IgG của chuột cộng hợp với horseradish peroxidase HRP (Abcam).
. 2.2.3.4. Phương pháp tính tần số/hiệu quả chuyển gen:
Được tính bằng số dòng cây dương tính với phản ứng PCR/Tổng số mẫu biến nạp.