Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN
3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA
Các tế bào miễn dịch không phản ứng hoặc không nhận diện toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chúng chỉ nhận diện những vị trí nhất định trên phân tử kháng nguyên. Những vị trí đó đƣợc gọi là epitope hoặc vị trí quyết định kháng nguyên.
trên protein HA virus cúm A/H5N1, :
Epitope B:
Ser-Lys-Ala-Phe-Ser-Asn-Cys-Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala- Ser-Leu
Epitope T:
Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu -Lys-Leu-Ala-Thr
- -
virus cúm
.
V bao gồm
signal peptide (2S2),
(LTB),
(Hình 3.1).
3.1. SLHEP (A) (B)
3.1.1.1. Tổng hợp gen HA chứa mã bộ ba biểu hiện cao trong thực vật
Sự biểu hiện protein tái tổ hợp là hướng đi cơ bản của công nghệ sinh học hiện đại. Tuy nhiên các protein rất khó biểu hiện ở cơ thể khác loài. Một số mã bộ ba rất dễ biểu hiện cao trong loài này nhƣng không biểu hiện hay biểu hiện thấp trong loài khác. Mục tiêu của nghiên cứu này là biểu hiện gen HA của virus H5N1 ở cơ thể thực vật, do vậy cần thiết phải thay đổi một số mã bộ ba nhằm làm tăng mức độ biểu hiện gen HA trong tế bào chủ.
Trên cơ sở trình tự gen HA và protein HA của virus H5N1 chúng tôi đã thiết kế nhân tạo gen HA (HAop) có khả năng biểu hiện tối ƣu ở thực vật và gửi tổng hợp tại công ty Geneart (Germany) sau đó đƣợc sử dụng để ghép nối vào vector p201-SLHEP. Gen nhân tạo HAop gồm 1695 nucleotide và có sự thay đổi một số mã bộ ba nucleotide, nhƣng trình tự amino acid không thay đổi (Hình 3.2).
ANKLFLVCAALALCFLLTNALDAPQSITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMV IITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAA ISMENSDPHVPNLDLEEFEWSYIVEKANPVNDLCYPGGGECPKYVKSNRLVLATGLRNSK DEQKLISEEDLNGSKDEL.
(A)
(B)
ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAA M E K I V L L L A I V S L V K S D Q I C I G Y H A N N ATGGAAAAGATTGTGCTTTTGCTTGCTATTGTGTCTCTTGTGAAGTCTGATCAGATCTGCATTGGATACCACGCTAACAA CTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACA S T E Q V D T I M E K N V T V T H A Q D I L E K T H CTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACA ACGGGAAGCTCTGCGCTCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAAC N G K L C A L D G V K P L I L R D C S V A G W L L G N ACGGAAAGTTGTGCGCTCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAAC CCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTA P M C D E F I N V P E W S Y I V E K A N P V N D L C Y CCAATGTGTGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGCTA CCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCC P G D F N D Y E E L K H L L S R I N H F E K I Q I I CCCTGGTGATTTCAACGATTACGAAGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTC CCAAAAGTTCTTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCAGGGAAAGTCCTCCTTTTTC P K S S W S S H E A S L G V S S A C P Y Q G K S S F F CAAAGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTTC AGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGA R N V V W L I K K N S T Y P T I K R S Y N N T N Q E D AGGAACGTTGTTTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAAGA TCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGATAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATA L L V L W G I H H P N D A A E Q I K L Y Q N P T T Y TCTTTTGGTTCTTTGGGGAATTCACCACCCAAATGATGCTGCTGAACAGATTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACA TTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGA I S V G T S T L N Q R L V P R I A T R S K V N G Q S G TTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATCTGGA AGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCGGA R M E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N F I A P E AGGATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGA ATATGCATACAAACTTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGCAACTGCAACACCAAGT Y A Y K L V K K G D S T I M K S E L E Y G N C N T K Q GTACGCTTACAAGTTGGTGAAGAAGGGTGATAGTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGT GTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAA T P M G A I N S S M P F H N I H P L T I G E C P K GCCAAACTCCAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAA TATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAACGAGAGACGCGAGGATTATTTGGAGC Y V K S N R L V L A T G L R N S P Q R E R R G L F G A TACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAACTCTCCACAGAGAGAAAGAAGGGGACTTTTCGGAGC TATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAACGAGCAGGGGA I A G F I E G G W Q G M V D G W Y G Y H H S N E Q G TATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAACGAGCAAGGAT GTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATTATTGACAAA S G Y A A D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I I D K CTGGATATGCTGCTGATAAGGAATCTACTCAGAAAGCTATTGATGGTGTTACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAG ATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGA M N T Q F E A V G R E F N N L E R R I E N L N K K M E ATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGAGAGTTCAACAACCTTGAGAGAAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGA
AGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTAGTTCTCATGGAAAACGAGAGAACTCTAGACTTTCATG D G F L D V W T Y N A E L L V L M E N E R T L D F H AGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACG ACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTC D S N V K N L Y D K V R L Q L R D N A K E L G N G C F ATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAAGAGCTTGGAAACGGTTGCTTC GAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGA E F Y H K C D N E C M E S V R S G T Y D Y P Q Y S E E GAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCATGGAATCTGTGAGATCTGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAAGA AGCAAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATATTGTCAATTTATTCTA A R L K R E E I S G V K L E S I G I Y Q I L S I Y S AGCTAGGCTTAAGAGGGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTATTTACCAGATTCTTTCTATTTACTCTA CAGTGGCGAGCTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGC T V A S S L A L A I M V A G L S L W M C S N G S L Q C CTGTGGCTTCTTCTCTTGCTCTTGCTATTATGGTGGCTGGACTTTCTCTTTGGATGTGCTCTAACGGATCTCTTCAGTGC AGAATTTGCATTTAA
R I C I . AGGATCTGCATTTAA
Hình 3.2 HA (HAop)
Trình tự trên: trình tự gen HA củ /Hatay/2004/(H5N1) AJ867074); trình tự ở giữa: trình tự amino acid; trình tự dưới: trình tự
nucleotide đã đƣợc thay đổi
3.1.1.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA Kết quả khuếch đại gen HA
Dựa trên trình tự gen HA, cặp mồi đặc hiệu XhoI-HA/HindIII-HA đã đƣợc thiết kế (Bảng 3.1), trong đó các nucleotide in nghiêng đậm là trình tự nhận biết của enzyme cắt hạn chế XhoI và HindIII, các nucleotide in thường là trình tự tương đồng với gen HA.
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA
Tên mồi Trình tự
XhoI-HA CCGCTCGAGATCTGCATTGGATACCACGCT HindIII-HA CCCAAGCTTGCAGATCCTGCACTGAAGAGAT
Hiệu quả của phản ứng PCR có thể giảm do những nguyên nhân nhƣ nồng độ muối quá cao, hay quá thấp, nhiệt độ bắt cặp mồi không thích hợp, lƣợng plasmid quá nhiều...Vì vậy trong quá trình thực hiện phản ứng chúng tôi đã tiến hành điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp mồi, lƣợng mẫu, nồng độ mồi để đảm bảo phản ứng xảy ra đặc hiệu nhất. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% cùng với thang DNA chuẩn 1kb (Hình 3.3) cho thấy kết quả nhận được một đoạn DNA có kích thước khoảng 1,7 kb phù hợp với kích thước gen HA theo tính toán lý thuyết.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen HA bằng XhoI-HA/HindIII-HA (M: Thang DNA chuẩn 1kb)
Tinh sạch sản phẩm PCR
Để ghép nối sản phẩm PCR- đoạn gen HA vào vector tách dòng có hiệu quả thì sản phẩm PCR phải đƣợc làm sạch loại bỏ các thành phần có tạp chất trong sản phẩm PCR nhƣ mồi, đệm, enzyme. Khi dung dịch qua cột tinh sạch
-1kb
1 M
-6 kb
-3 kb
1,7 kb
M
DNA sẽ đƣợc gắn vào phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose đƣợc loại bỏ nhờ ly tâm tốc độ cao, sau đó DNA được thu lại bằng nước khử ion. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.4).
M HA
Hình 3.4. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel (M: thang DNA 1kb)
Kết quả ở hình 3.4 cho thấy sản phẩm PCR đã đƣợc tinh sạch có hàm lượng cao không bị đứt gãy, đúng với kích thước, đảm bảo cho việc tiến hành các phản ứng tiếp theo.
Ghép nối đoạn gen HA vào vector p201-SLHEP
Sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc xử lý đồng thời bởi hai enzyme XhoI/HindIII và đƣợc nối vào vector p201-SLHEP. Trên vector có 2 vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển sẽ đƣợc xen vào giữa 2 vị trí này.
Trên vector còn chứa gen kháng kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi, phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn. Nhờ enzyme nối mà các đầu của sản phẩm PCR sẽ đƣợc ghép vào vector, kết quả plasmid tái tổ hợp p201-SLHEP-HA đƣợc tạo thành. Sơ đồ của thí nghiệm
1,7 kb 1kb -
ghép nối đoạn gen HA vào vector p201-SLHEP đƣợc thể hiện ở hình 3.5. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 250C trong 90 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
Hình 3.5. Sơ đồ thí nghiệm ghép nối gen HA/HA1 vào vector p201- SLEHP tạo p201-SLEHP-HA/HA1
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α
Plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo ra từ phản ứng ligation sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc,
nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn. Kết quả của quá trình biến nạp đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli
Hình 3.6 cho thấy kết quả thu đƣợc các khuẩn lạc mọc đƣợc trên môi trường chọn lọc. Từ đây có thể kết luận sơ bộ rằng đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp p201- SLHEP-HA vào tế bào E. coli. Tuy nhiên, các khuẩn lạc thu đƣợc có thể mang vector tái tổ hợp hoàn chỉnh hoặc chỉ là khuẩn lạc mang các plasmid thường, không chứa gen đích hay gen đích bị đứt gãy cần phải tiến hành chọn lọc. Để có thể chọn lọc đƣợc những dòng khuẩn lạc mang vector chứa gen HA còn nguyên vẹn nhƣ mong muốn, chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid từ những khuẩn lạc và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn.
Chọn plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế
Để khẳng định chắc chắn rằng gen HA đã đƣợc gắn vào vector chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt plasmid với enzyme giới hạn XhoI/HindIII. Theo tính toán lý thuyết, khi cắt bằng 2 enzyme giới hạn
XhoI/HindIII sẽ thu đƣợc sản phẩm gồm 2 phân đoạn DNA: (i) Đoạn gen HA cần chèn vào vector bị cắt ở 2 đầu bởi 2 enzyme giới hạn có kích thước khoảng 1,7kb và (ii) Khung vector còn lại sau khi cắt bỏ gen chèn có kích thước khoảng 2,5kb. Sản phẩm phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong Hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp p201-SLHEP-HA
Từ kết quả kiểm tra ở Hình 3.7 cho thấy cả 3 dòng khuẩn lạc tiến hành kiểm tra đều đã cho các băng DNA với kích thước như mong muốn. Điều này chứng tỏ rằng đoạn gen HA đã đƣợc chèn thành công vào vector p201- SLHEP và kết quả tạo ra vector tiếp nhận p201-SLHEP-HA làm nguyên liệu cho việc thiết kế vector chuyển gen theo kỹ thuật Gateway®.
3.1.1.4. Thiết kế vector mang cấu trúc HAop biểu hiện đặc trƣng ở hạt Kỹ thuật Gateway là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện protein và dòng hóa đoạn DNA. Dựa vào điểm đặc hiệu trong hệ thống tái tổ hợp của phage I. Kỹ thuật Gateway cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng khác
2,5kb 1,7kb
nhau trong khi vẫn duy trì định hướng chính và cấu trúc đọc, thay thế việc sử dụng enzym cắt giới hạn và enzym nối hiệu quả. Kỹ thuật Gateway là một phương pháp có hiệu quả cao cho việc tạo dòng có định hướng của các sản phẩm PCR. Kỹ thuật Gateway gồm có hai loại phản ứng LR và BP. Trong nghiên cứu này các cấu trúc gen chứa HA và các gen mã hóa các peptid chức năng đã đƣợc thiết kế chuyển vào vector pPhaso-dest bằng phản ứng LR của hệ thống Gateway. Các cấu trúc đều đƣợc kiểm soát sự biểu hiện bởi promotor đặc trƣng trong hạt Phasoline (Hình 3.8).
3.8 - -dest tạo vector pPhaso-dest-HA/HA1
Sản phẩm của phản ứng LR là một vector tái tổ hợp đƣợc kí hiệu là pPhaso-HA. Để thu đƣợc dòng plasmid pPhaso-HA thì hỗn hợp phản ứng LR phải đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh. Tuy nhiên, để xác định chính xác các plasmid tái tổ hợp mới đƣợc tạo thành đúng nhƣ mong đợi, chúng tôi đã sử dụng các phản ứng cắt bởi enzym giới hạn và PCR.
XhoI-HA/Hind - 1,7 kb. Còn
kết quả kiểm tra bằ EcoRI cho thấy sả
hoàn toàn the ết (Hình 3.9).
3.9. Hình ả -HA
A: Kết quả kiể : kết quả kiểm tra bằng phản ứ EcoR
ạc
Nhƣ vậy qua kết quả của phản ứng cắt bằng enzym giới hạn và bằng phản ứng colony-PCR đã khẳng định chắc chắn cả 3 dòng khuẩn lạc đều có chứa vector chuyển gen pPhaso- HA hay nói cách khác cấu trúc gen HA đã đƣợc thiết kế thành công vào vector biểu hiện ở thực vật p.Phaso-dest. Từ kết quả trên chúng tôi đã lựa chọn dòng plasmid số 1 sử dụng cho biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens
3.3.3.5. Kết quả tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp
Để kiểm tra hoạt động của gen HA trên vector tái tổ hợp trong cây trồng cũng nhƣ tạo ra nguyên liệu chuẩn bị cho quá trình chuyển gen vào cây đậu tương thì vector tái tổ hợp pPhaso-HA đã được biến nạp vào vi khuẩn A.
tumefaciens bằng xung điện. Đây là phương pháp biến nạp có hiệu quả cao đồng thời rút ngắn đƣợc thời gian thí nghiệm. Sản phẩm sau khi biến nạp đƣợc cấy trải trên các đĩa chọn lọc có chứa các kháng sinh spectomicin 50 mg/l và rifamicine 50 mg/l.
Kết quả của quá trình biến nạp đã thu đƣợc các khuẩn lạc màu trắng.
Tuy nhiên để khẳng định chắc chắn vector đã đƣợc biến nạp thành công chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩ ặp
mồi đặc hiệu XhoI/HindIII-HA trên hình 3.10 cho thấy dòng khuẩn lạc đƣợc lựa chọn cho kết quả dương tính với phản ứng PCR với một băng duy nhất có kích thước 1,7kb. Điều này đã chứng tỏ kết quả biến nạp thành công vector pPhaso-HAop vào tế bào A. tumefaciens và nhƣ vậy chúng tôi đã tạo đƣợc chủng Agrobacterium mang plasmid tái tổ hợp pPhaso-HA.
3.10. Hình ảnh điện di sản phẩ
Agrobacterium tumefaciens CV58
M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-2: Dòng khuẩn lạc A. tumefaciens
Chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pPhaso- HA đƣợc sử dụng để lây nhiễm vào mô đã gây tổn thương phục vụ cho mục đích chuyển gen vào cây trồng.
3.1.1.5. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen HA Tái phục vụ chuyển gen là kỹ thuật
,
. V
thông qua sự có mặt và sự biểu hiện của gen chuyển.
Chúng tôi đã tiến hành chuyển cấu trúc vector mang cấu trúc gen HA vào cây thuốc lá theo quy trình tái sinh đƣợc thể hiện ở hình 3.11. Các khuẩn lạc A. tumefaciens sau khi đƣợc khẳng định mang gen đích đã đƣợc nuôi
1,7kb 1,5kb
trong môi trường YEP lỏng đến mật độ khuẩn đo được OD = 0,8-1,0 được đem biến nạp vào cây thuốc lá thông qua lây nhiễm các mảnh lá (Hình 3.11 A).
Kanamycin (Hình 3.11 C) và đã đƣợc kiểm tra sự có mặt của gen chuyển HAop bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu EcoRI-HA/HindIII-HA (Hình 3.12).
Hình 3.11. Sơ đồ mô tả sự tái sinh và chuyển gen HA ở cây thuốc lá A: Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn; B: Mảnh lá trên môi trường
cộng sinh sau 2 ngày; C: Cụm mô sẹo trên môi trường chọn lọc; D: Các chồi trên môi trường ra rễ; E: Cây thuốc lá trên môi trường ra rễ sau 2 tuần; F:
Cây thuốc lá trồng ra bầu trấu-cát
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR k HA
1 Kb; Đường chạy số 1 ;
Đường chạy số 2, 3, 4, 5, 6, 7: cây HA
Kết quả ở hình 3.12 cho thấy sản phẩm PCR có một băng DNA có kích thướ 1,7kb xuất hiện ở dòng các dòng cây chuyể 7. Kết quả thu được đoạn gen HA có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết.