Nhiệt độ: Một trong những điều kiện môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật là nhiệt độ. Tuỳ thuộc vào nhiệt độ và các chủng giống khác nhausẽ tạo ra tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn B. thuringiensis. Nuôi cấy ở nhiệt độ 25 – 400C trong 24 giờ sẽ thu đƣợc những khuẩn lạc đầu tiên. Ở nhiệt độ 12 – 150C, dưới loài B. thuringiensis subsp. thuringiensis cần 115 giờ, dưới loài subsp. alesto, H3ac, subsp. sotto, H4ab, subsp. entomocidus, H6ab cần 312 giờ để tạo thành bào tử. Sự hình thành bào tử cũng chịu ảnh hưởng rõ rệt của nhiệt độ, khi nhiệt độ nuôi cấy từ 200C nâng lên 350C chu kỳ phát triển giảm từ 64 giờ còn 27 giờ, số bào tử tăng lên. Nhiệt độ môi trường lên men tăng đến 400C sẽ trở ngại cho sự hình thành bào tử, thậm chí nuôi 7 ngày đêm, sự hình thành bào tử vẫn bị ức chế, thể dinh dưỡng dần bị tan ra. Khi nuôi ở 42oC trên môi trường thạch, B.
thuringiensis hình thành khuẩn lạc dạng núm vú và không hình thành bào tử. Nhiệt
22 độ không chỉ ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử mà còn có ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành tinh thể. Ở nhiệt độ dưới 14oC, sau 360 giờ, không quá 10% tinh thể đƣợc hình thành, nhƣng ở nhiệt độ 16oC nuôi 168 giờ thì tinh thể tăng lên nhiều nhất đạt 15%. Ở nhiệt độ 28oC vi khuẩn B. thuringiensis hoàn thiện 1 chu kỳ phát triển bình thường chỉ cần 48 - 72 giờ (Ngô Đình Bính và cộng sự, 2007).
Độ pH: Độ pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của khuẩn B.
thuringiensis, ion H+ trực tiếp tham gia chuyển dịch điện tử trong hoạt động trao đổi chất của sinh vật. Giá trị pH quá cao hoặc quá thấp đều có hại đối với vi khuẩn B. thuringiensis. pH ảnh hưởng đến điện tích màng tế bào và sự hấp thu chất dinh dưỡng của vi khuẩn, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym; làm thay đổi khả năng cho nhận chất dinh dưỡng trong môi trường và tính độc của các vật chất có hại (Ngô Đình Bính và cộng sự, 2007; 2009).
Ôxy: Sự sinh trưởng của B. thuringiensis quan hệ mật thiết với ôxy do vi khuẩn B. thuringiensis là trực khuẩn hình thành bào tử, hô hấp hiếu khí. Nhìn chung, khi lƣợng thông khí tăng, sinh khối tăng nhiều, số bào tử cao. Thiếu ôxy trong giai đoạn cân bằng sẽ làm giảm sự hình thành bào tử dẫn đến giảm hàm lƣợng độc tố trong dịch lên men, nhƣng quá nhiều dƣỡng khí sẽ tác động lên năng lực sống của tế bào, dẫn đến sự phân giải sớm làm giảm sự phát triển (Ngô Đình Bính và cộng sự, 2003; Nguyễn Thị Hoài Trâm và cộng sự,2004).
Ánh sáng và tia xạ: Ánh sáng và tia xạ có tác dụng kích thích, ức chế hoặc giết chết vi khuẩn B. thuringiensis. Ánh sáng và tia xạ có tác dụng điện ly, phá hoại protein và axít nucleic của tế bào bởi đó là một dạng năng lƣợng truyền qua không gian dưới dạng sóng điện từ,. Tia tử ngoại trong tia sáng mặt trời cũng có tác dụng gây chết với vi khuẩn B. thuringiensis. Mặc dù khi qua tầng khí quyển tia tử ngoại cũng đã yếu đi nhƣng nếu chiếu một thời gian dài thì vẫn có tác dụng gây chết. Bào tử vi khuẩn B. thuringiensis bị chiếu trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời 3.200 Lux trong 1 giờ sẽ mất hoạt tính 80%. Bào tử hấp thu khác nhau với các bước sóng khác nhau. Trong phạm vi 290 - 400 nm tỷ lệ chết cao nhất. Vì vậy,để giảm tác dụng của
23 ánh sáng mặt trời đối với chế phẩm B. thuringiensis trong các chế phẩm có thể thêm vào một số chất phụ gia khác nhƣ diatomite… (Ngô Đình Bính,2003;Nguyễn Thị Hoài Trâmvà cộng sự, 2001).
Chất kháng sinh và các thuốc trừ sâu hóa học: Chất kháng sinh và thuốc trừ sâu hóa học cũng là những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn B. thuringiensis. Kháng sinh thêm vào giữa pha logarit sẽ làm cho vi sinh vật dừng sinh trưởng đột ngột. Việc thêm kháng sinh chloramphenicol vào cuối thời kì logarit không ảnh hưởng đến sự hình thành của bào tử và tinh thể.
Erythromixin cũng có thể ức chế sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. thuringiensis, nhưng không ảnh hưởng đến sự sản sinh tinh thể. Các chủng phụ khác nhau cũng có tính mẫn cảm kháng sinh khác nhau. Các thuốc diệt sâu có nguồn gốc hoá học khác nhau cũng ảnh hưởng không giống nhau lên sự nảy mầm bào tử và sự sinh trưởng (Ngô Đình Bính,2003).
1.1.7. Nhu cầu dinh dưỡng của Bacillus thuringiensis 1.1.7.1. Nguồn các bon
V i khuẩn B. thuringiensis thường sử dụng tinh bột, bột ngô, dextrin, đường gluco, rỉ đường là nguồn cung cấp cácbon. Trong các nguồn cácbon trên thành phần đường chủ yếu là đường kép. Trong quá trình sinh trưởng, visinh vật sản sinh ra các enzym phân hủy đường kép thành đường đơn sau đó vi sinh vật mới sử dụng làm nguồn dinh dƣỡng.
Bảng1.2.Thành phần một số môi trường lên men sản xuất chế phẩmBT Thành phần Tỷ lệ phối chế môi trường (g/l)
Bột đậu tương 25,0 22,5 - 40,0 - 18,0 25,0 40,0
Bột khô lạc - - 30,0 - 14,0 - - -
Bột ngô - - - 5,0 - 20,0
Nước ngâm ngô - 20,0 30,0 20,0 16,7 36,0 3,0 -
Tinh bột 10,0 15,0 - - -7,5 - - -
Bột cá - - - 3,0 5,0 10,0
Pepton - - 2,0 - - - - 1,0
24 Thành phần Tỷ lệ phối chế môi trường (g/l)
Đường gluco 10,0 - 45,0 30,0 - - 20,0 -
Rỉ đường - - - - 18,6 - - -
Cao nấm men - - 2,0 - - - - 2,0
KH2PO2 1,0 - - - - 2,16 1,0 1,0
K2HPO44 1,0 - - - -
FeSO4.7H2O O
0,02 - 0,02 - - - - -
MgSO4.7H2O - - 0,3 - - 0,75 - 0,7
MnSO4.7H2O - - 0,02 - - - - -
ZnSO4.7H2O - - 0,02 - - - - -
CaCO3 1,0 1,5 - - 1,0 1,5 1,0 2,0
(NH4)2SO4 - - - 2,0 -
Trong môi trường có chứa lượng gluco thích hợp sẽ có thể thúc đẩy vi khuẩn B. thuringiensis phát triển, rút ngắn thời gian lên men. Trong lên men dịch thể bình thường, tinh bột được sử dụng phổ biến, nó có thể khắc phục sự chuyển hoá quá nhanh của gluco, duy trì một nguồn đường nhất định ở hậu kỳ lên men. Hơn nữa nguồn tinh bột luôn sẵn có, giá thấp. Tuy nhiên, nồng độ của hợp chất các bon này cần phải khống chế ở một phạm vi thích hợp. Trong môi trường dinh dưỡng có tồn tại cả 2 yếu tố các bon và nitơ, khi vi khuẩn B. thuringiensis sử dụng đường gluco sẽ sinh ra nhiều axít, nếu nồng độ đường quá cao, độ pH sẽ giảm xuống dưới 5,6 - 5,8 mức độ pH này sẽ gây ức chế hoặc cản trở sự sinh trưởng của vi khuẩn. Trong thực tế, rất khó để xác định nồng độ đường “quá cao” là bao nhiêu mà phải căn cứ vào nguồn đạm có trong môi trường. Trong quá trình sinh trưởng B. thuringiensis sử dụng nguồn nitơ sẽ sinh ra một số chất có tính kiềm, có thể trung hoà nhữ ng axít do đường sản sinh. Ngược lại nồng độ đường quá thấp cũng sẽ nhanh chóng làm cho vi khuẩn B. thuringensis ngừng sinh trưởng. Cho nên nguồn đường và đạm phải duy trì một tỷ lệ nhất định để pH của dịch lên men trong những giờ đầu của quá trình lên men có thể hạ xuống 5,8-6,0, sau đó ổn định dần, lên cao đến trên 8,0 khi kết thúc lên men (Ngô Đình Bính, 2003; Nguyễn Thị Hoài Trâm; 2004; Nguyễn
25 Văn Tuất, 2004).
1.1.7.2. Nguồn nitơ
Nguồn đạm đƣợc tạo ra từ nhiều dạng khác nhau. Một số nguồn đạm hữu cơ được sử dạng rộng rãi như: bột đậu tương, bột khô dầu hạt bông, bột khô lạc, bột cá, nước ngâm ngô, pepton.... Trong đó bột đậu tương và bột khô dầu là hai nguồn đạm thường được sử dụng nhất. Tuy nhiên, hiệu quả của các nguồn đạm lên các loại visinh vật khác nhau là không giống nhau. Do vậy, cần tiến hành các thí nghiệm thực tế trên từng loài vi sinh vật để xác định nguồn đạm phù hợp nhất cho mục đích lên men với từng loài vi sinh vật cụ thể (Ngô Đình Bính, 2000; Zouari và Jaoua, 1999).
1.1.7.3.Nguồn khoáng chất
Nhiều nguyên tố khoáng không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn. Trong đó, các ion kim loại nhƣ Mg, Mn, Fe, Zn, Ca… có tác dụng điều tiết quan trọng đến sinh trưởng và hình thành bào tử. Cho nên trong môi trường có thể cho thêm một số muối: 0,3 % MgSO4.7H2O; 0,02 % MnSO4.7H2O;
0,02 % FeSO4.7H2O; 0,2% ZnSO4.7H2O và 1,0% CaCO3 (Ngô Đình Bính, 2000).
Theo các nghiên cứu của nhóm tác giả Braun cộng sự; Icgen và cộng sự cho thấy sự thiếu của một trong hai muối Mg2+ và Mn2+ sẽ làm giảm khả năng sinh trưởng, hình thành bào tử nhưng ảnh hưởng lớn nhất phát hiện được là giảm khả năng tổng hợp độc tố. Magie là trung tâm điều khiển hoạt động của enzym, bằng hoạt động của magie một vài enzym bao gồm cả bào tử đƣợc hình thành (Braun, 2000; Icgen và cộng sự, 2002). Kết quả nghiên cứu của Ozkan và các cộng sự cũng chỉ ra rằng Magie có vai trò quan trọng trong việc hình thành độc tính ở nồng độ 8x10-3M (Ozkan và cộng sự, 2003).
Bên cạnh những môi trường tổng hợp để sản xuất chế phẩm sinh học BT, các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nhiều nghiên cứu tận dụng những nguồn nguyên liệu rẻ tiền nhƣ: bùn thải sinh học, các chất phế thải nông nghiệp làm môi trường sản xuất nhằm giảm giá thành sản phẩm. Những kết quả nghiên cứu của tác
26 giả Khanh và các cộng sự cho thấy bùn thải sinh học của nhà máy sản xuất tinh bột hoàn toàn có thể thay thế cho môi trường tổng hợp để nuôi cấy B. thuringiensis (Khanh và cộng sự, 2009). Nghiên cứu của tác giả Maria và các cộng sự cho thấy bùn thải của quá trình xử lý nước thải hoàn toàn có thể sử dụng làm nguyên liệu lên men vi khuẩn BT sản xuất thuốc trừ sâu sinh học (Maria và cộng sự, 2001). Nghiên cứu của Subbiah và các cộng sự cũng cho thấy có thể tận dụng bột lông vũ từ các trạm giết mổ gia cầm thay thế môi trường tổng hợp sản xuất chế phẩm sinh học diệt bọ gậy (Subbiah và cộng sự, 2012). Gần đây Songqing và các cộng sự cũng nghiên cứu tận dụng giá thể trồng nấm làm môi trường lên men cho B. thurigiensis bằng phương pháp lên men bề mặt, thu được sản phẩm có hoạt tính đạt 1,487 UI/mg (Songqing và cộng sự, 2014).
1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn B. thuringiensis ở Việt Nam Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về B. thuringiensis ở Việt Nam đƣợc khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác giả nhƣ Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu tiên mở đường nghiên cứu về B. thuringiensis tại Việt Nam (Đặng Trọng Lương và cộng sự, 1999).
Thời kỳ đầu, các nghiên cứu, công bố khoa học về B. thuringiensis còn rất ít. Một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B. thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng các chủng B.
thuringiensis thuộc loài phụ B. thuringiensis var. thuringiensis, B. thuringiensis var.
kurstaki. Các chế phẩm B. thuringiensis này đã đƣợc sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và thu đƣợc các kết quả tốt. Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất ra có chất lƣợng khbông cao nên tốc độ tiêu thụ giảm (Phan Cự Nhân và cộng sự, 2004; Đặng Trọng Lương và cộng sự, 1999).
Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994). Ở thời kỳ này, các chế phẩm B.
thuringiensis sản xuất theo phương pháp dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có giá thành hợp lý nên đƣợc nông dân ƣa
27 chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc các trường đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm B. thuringiensis theo phương pháp lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt (Đặng Trọng Lương và cộng sự, 1999).
Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay).
Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm B. thuringiensis kém chất lƣợng không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng B. thuringiensis bước vào thời kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy các nhà khoa học đã chuyển việc nghiên cứu B. thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các chủng B.
thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển gene B.
thuringiensis phục vụ sản xuất (Đặng Trọng Lương và cộng sự, 1999). Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cộng sự cho thấy các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003).
Năm 1998, có 34 chủng chuẩn mang kháng nguyên tiêm mao H và đã chế tạo được 34 bộ sinh phẩm (kit) phục vụ cho phân loại B. thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh. Phương pháp PCR với hỗn hợp các cặp mồi đặc hiệu cho 7 gen thuộc nhóm gen cry typ 1 cho thấy có 102 chủng B. thuringiensis trong tổng số 115 chủng có chứa 311 gen cry1 (chiếm 88,7%), đáng chú ý là các chủng chứa 5 gen cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1C và cry1D - chiếm 6,8% (Đái Duy Ban, 2006).
Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng B.
thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli từ các chủng Bt. aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các protein tái tổ hợp thu đƣợc đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đôi chứng. Năm 2000, Võ Thị Thứ và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein cry4A diệt ấu trùng muỗi. Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông (Đái Duy Ban, 2006).
28 Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã đƣợc bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium fumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu nhƣ: cây đậu xanh, cây cải bông...(Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự, 2004; Khuất Hữu Thanh và cộng sự, 2003; Đặng Trọng Lương và cộng sự, 1999). Năm 2012, Phan Tường Lộc và cs đã chuyển gen cry1Ab và cry1B-cry1Ab vào cây mía thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Phan Tường Lộc và cộng sự, 2012).
1.2. Gen cry2
Các gen cry2 mã hóa protein tinh thể khoảng 65 – 71 kDa, đƣợc sản sinh bởi một số phân loài của B. thuringiensis nhƣ: kurstaki (HD-1, HD-263, NRD-12 và 14 dòng khác), thurigiensis, tolwwarthi, israelensis, kenyae… (Dwu và cộng sự, 1991; Ohba và Aizawa, 1986; Yamamoto, 1983). Cho đến nay, hơn 80 gen cry2 đã đƣợc phát hiện (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/B.thuringiensis/toxins2.html).Wi nder và Whiteley (1989) tách dòng hai gen liên quan đến cry2A và cry2B từ vi khuẩn B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1. Cả hai gen mã hóa protein chứa 633 axit amin với khối lượng phân tử khoảng 71 kDa. Mặc dù hai protein Cry tương đồng tới 87%
axit amin, nhƣng chúng khác nhau trong phổ diệt côn trùng. Cry2A độc hại đối với loài cánh vảy (M. sexta) và hai cánh (A. aegypti), trong khi đó Cry2B và Cry2C gây độc cho loài cánh vảy. Các gen cry2A và cry2C xuất hiện nhƣ vùng gen thứ ba của một operon ba gen (Orf1, Orf2 và cry2A) (Yamamoto and McLaughlin, 1981). Tuy nhiên sự hình thành protein Cry2A đòi hỏi phải có khung đọc mở (Orf2), trong khi hai Orf phía đầu của gen cry2C không có vai trò trong hình thành protein Cry2C (Duong và cộng sự, 2013). Mặt khác, gen cry2B là rất khó xác định. Để có đƣợc biểu hiện mạnh hơn của một gen cry2B từ B. thuringiensiskurstaki HD-1, Dankocsik và cộng sự (1990) đã hợp nhất gen này tại vùng điều hòa của một gen cry3A. Kết quả là các độc tố Cry2B có độc tính cao với bộ cánh màng bao gồm Lymantria dispar, Heliothis virescens, Trichoplusiani. (Dankocsik và cộng sự, 1990).