3.3. Lựa chọn môi trường và tối ưu lên men làm tăng khả năng hình thành
3.3.3. Tối ưu hóa môi trường lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã bia
Các kết quả nghiên cứu trên đây cho thấy: khi bổ sung thêm một số thành phần dinh dưỡng như: MnSO4, MgSO4.7H2O, bột đậu tương vào dịch thủy phân bã bia đã làm tăng hiệu quả lên men vi khuẩn MSS8.4. Tuy nhiên những kết quả trên mới chỉ đánh giá đƣợc tác động độc lập của các yếu tố mà chƣa đánh giá đƣợc tác động cộng hưởng, tương tác giữa các yếu tố với nhau. Các kết quả thí nghiệm đánh giá tác động độc lập của các yếu tố đơn lẻ khi bổ sung vào môi trường bã bia thủy phân cũng cho thấy rằng nồng độ protein tinh thể không hẳn lúc nào cũng tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Với mục tiêu thu đƣợc hàm lƣợng protein tinh thể lớn nhất, trong phần tối ưu hóa thành phần môi trường cho lên men MSS8.4 sẽ chỉ quan tâm đến hàm đích là nồng độ protein tinh thể. Thành phần các chất bổ sung đƣợc xác
108 định theo phương pháp đáp ứng bề mặt với các miền khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng như sau: nồng độ Mn (A) 0,0 – 0,1 g/l; nồng độ Mg (B) 0 – 0,8 g/l; nồng độ bột đậu tương (C) 0 – 5 g/l. Bằng phần mềm phần mềm Design expert 10.1 thu được ma trận gồm 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng (Bảng 3.11). Các thí nghiệm đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần lấy kết quả trung bình của các lần lặp lại đƣa vào xử lý thống kê bởi phần mềm phần mềm Design expert 10.1.
Phương pháp đáp ứng bề mặt cho phép đánh giá sự tác động đồng thời của các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả sinh tổng hợp protein tinh thể, từ đó tìm ra phương án thu đƣợc hiệu quả cao nhất. Kết quả kiểm tra sự có ý nghĩa của các hệ số và sự thích ứng của mô hình bằng phân tích hồi quy trình bày ở bảng 3.11.
Kết quả phân tích hồi quy của mô hình ở bảng 3.11 cho thấy: giá trị p của mô hình <0,0001 cho thấy mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99%. Sự có ý nghĩa của các hệ số hồi quy đƣợc kiểm định bởi chuẩn F, các giá trị P lớn hơn F ít hơn 0,05 cho biết mô hình có nghĩa. Trong trường hợp này các yếu tố A, B, C đều có p<0,05 nên cả ba yếu tố này đều thể hiện là các yếu tố có tác động đến hàm lƣợng protein tinh thể trong dịch lên men. Trong bảng 3.11 cũng cho thấy sự kết hợp của AB, BC không thể hiện rơ sự tác động biểu hiện ở giá trị P>0,1 tuy nhiên các yếu tố này vẫn đƣợc giữ trong mô hình để tiến hành tối ƣu hóa.
Bảng 3.11. Kết quả phân tích hồi quy nồng độ protein tinh thể Thông số
Tổng phương sai
(Sum of Squares)
Bậc tự do (degrees
of freedom)
Trung bình phương sai khác (Mean
Square)
Chuẩn Fisher
(F)
Giá trị P (khả năng> F)
Mô hình 0.023 9 2.562E-003 112.01 < 0.0001
A-BĐT 2.351E-004 1 2.351E-004 10.28 0.0094
B-MgSO4 2.358E-003 1 2.358E-003 103.11 < 0.0001 C-MnSO4 3.747E-004 1 3.747E-004 16.38 0.0023
AB 3.570E-005 1 3.570E-005 1.56 0.2400
109 Thông số
Tổng phương sai
(Sum of Squares)
Bậc tự do (degrees
of freedom)
Trung bình phương sai khác (Mean
Square)
Chuẩn Fisher
(F)
Giá trị P (khả năng> F)
AC 3.213E-004 1 3.213E-004 14.05 0.0038
BC 1.901E-006 1 1.901E-006 0.083 0.7790
A2 0.010 1 0.010 450.39 < 0.0001
B2 5.988E-003 1 5.988E-003 261.82 < 0.0001 C2 3.360E-003 1 3.360E-003 146.91 < 0.0001 Độ lệch thực
nghiệm
2.287E-004 10 2.287E-005
Sự không tương thích mô hình
1.611E-004 5 3.222E-005 2.38 0.1812
Sai số 6.760E-005 5 1.352E-005
Phương sai tổng số
0.023 19
Chuẩn F của sự không tương thích mô hình là 2,38 cho thấy: sự không tương thích của mô hình là không có ý nghĩa, chỉ có 18,12% cơ hội xuất hiện lỗi do độ nhiễu gây nên. Sự không có ý nghĩa của giá trị không tương thích của mô hình cho thấy mô hình hoàn toàn tương thích với thực nghiệm (Box and Wilson, 1951; Li và cộng sự, 2007).
Phương trình tính toán nồng độ protein tinh thể dự kiến của mô hình:
Nồng độ protein tinh thể = 308,51+44,25*A+1256,53*B+173,96*C + 21,125*A*B - 9,053*A*C +27,857*B*C - 7,227 *A2 - 10343,76*B2- 146,87*C2(Y)
110 Nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố (khi các yếu tố khác giữ ở mức trung tâm) đến sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis (Hình 3.26 D) cho thấy: cả ba yếu tố này đều ảnh hưởng mạnh đến sinh tổng hợp độc tố delta edotoxin của vi khuẩn MSS8.4. Trong đó, đứng đầu là bột đậu tương sau đó đến magie và mangan.
Giải bài toán tối ƣu hóa nồng độ protein tinh thể trong dịch lên men MSS8.4từ dịch thủy phân bã bia bằng cách chập mục tiêu theo thuật toán “hàm mong đợi”
bằng phần mềm phần mềm Design expert 10.1với 100 phương án được đưa ra (phụ lục II), dựa vào phương trình bậc hai (Y) để tính kết quả dự kiến theo lý thuyết cho 100 phương án. Theo kết quả dự tính của mô hình, nồng độ protein tinh thể thu đƣợc nằm trong vùng tối ƣu khi các yếu tố có dải nồng độ nhƣ sau: MnSO4 từ 0,05 – 0,09 g/l; MgSO4 từ 0,33 – 0,74 g/l và bột đậu tương từ 1,7 – 3,7 g/l. Trong vùng tác động này, giá trị protein tinh thể đạt từ 515mg/l – 525 mg/l (phụ lục 2 bảng 2).
A B
111 C
D
Hình 3.26.Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp độc tố protein tinh thể của chủng vi khuẩn Bt
A: nồng độ MgSO4 cố định, nồng độ MnSO4 và bột đậu tương thay đổi B: nồng độ MnSO4 cố định, nồng độ bột đậu tương và MgSO4 thay đổi
C: nồng độ bột đậu tương cố định, nồng độ MgSO4 và nồng độ MnSO4 thay đổi D: sự tác động đồng thời của cả 3 yếu tố
3.3.3.2.Kiểm tra sự tương thích của mô hình và thực nghiệm
Phương pháp bề mặt đáp ứng được thiết lập dựa trên số lượng hữu hạn các thí nghiệm thực nghiệm, do đó, có những điểm không phản ánh đúng giá trị thực của hàm mục tiêu. Để đánh giá kết quả của phương pháp, tiến hành kiểm chứng tại 5 phương án bất kỳ. Các phương án được chọn ngẫu nhiên ở đây là phương án 2, 16, 38, 47, 90, trong đó, phương án 16 và47 là 2 phương án nằm ngoàivùng tối ưu, phương án 2, 38, 90 là các phương án nằm trong vùng tối ưu. Ngoài ra, để đánh giá hiệu quả của mô hình, các thí nghiệm đƣợc thực hiện đồng thời với một mẫu đối chứng là môi trường dịch thủy phân bã bia không bổ sung dinh dưỡng và thí nghiệm lên men trên môi trường MTCS. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12.Hàm lƣợng protein tinh thể tính theo mô hình và thực nghiệm
112 Phương
án theo mô hình
Nồng độ bổ sung (g/l) Mật độ (CFU/ml)
Nồng độ protein tinh thể (mg/l)
MnSO4 MgSO4 BĐT TCC SC
Thực nghiệm
Mô hình 2 0,05 0,45 3,00 4,5x108 4,3x108 529,11±11 525 16 0,076 0,221 3,47 2,8x108 1,3x108 509,24±10 513 38 0,051 0,337 2,292 3,3x108 3,1x108 515,2±10 519 47 0,009 0,237 1,487 1,25x107 1,07x107 457±11 471 90 0,056 0,581 3,093 4,15x108 3,8x108 527,93±10 526 ĐC (MT bã bia thủy phân) 1,7x108 1,5x108 431±10 - Môi trường MTCS 5,10x108 4,5x108 530,14±12 -
Kết quả phân tích hàm lƣợng protein ở các thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt lớn giữa kết quả dự đoán của mô hình và thực nghiệm. Theo kết quả tính toán của mô hình, phương án 2 (Bảng 1 phụ lục 2) là phương án cho hàm lượng protein tinh thể cao nhất đạt 525 mg/l. Kết quả thực nghiệm (Bảng 3.12) cũng cho thấy đây là phương án cho nồng độ protein tinh thể cao nhất trong các phương án thí nghiệm. Như vậy, phương án tối ưu cho lên men vi khuẩn MSS8.4 từ bã bia được chọn là phương án 2 với thành phần cụ thể như sau: Dịch thủy phân bã bia (2,5%TS) + 0,05 g/l MnSO4+ 0,45 g/l MgSO4.7H20 + 3 g/l bột đậu tương. Khi đối chiếu với kết quả nghiên cứu đánh giá các yếu tốt độc lập cho thấy: MnSO4 nếu bổ sung trực tiếp vào môi trường bã bia mà không có mặt của các yếu tố khác như bột đậu tương và MgSO4.7H2O thì ở nồng độ 0,05 g/l nó đã bắt đầu ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn MSS8.4. Nhưng khi có sự tương tác của bột đậu tương và
113 MgSO4 thì đây lại là nồng độ giúp kích thích sự sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp protein tinh thể. Hai yếu tố còn lại là bột đậu tương, MgSO4.7H2O vẫn nằm trong khoảng có tác động tốt đến sinh trưởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4. Như vậy, để tạo môi trường lên men cho vi sinh vật cần có sự xem xét đến yếu tố tác động cộng hưởng để có được kết quả tốt nhất.
Kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.12 cũng cho thấy: Sau khi môi trường được tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt, hiệu suất lên men tăng lên đáng kể đặc biệt là nồng độ protein tinh thể. Mật độ tổng tế bào, bào tử và nồng độ protein tinh thểở dịch canh trường lên men sau khi môi trường đã được tối ưu lần lượt đạt 4,5x108CFU/ml, 4,3x108CFU/ml và 529,11 mg/l so với trước tối ưu là 1,7x108 CFU/ml, 1,5x108 CFU/ml và 431 mg/l. Như vậy, sau khi tối ưu môi trường lên men bằng phương pháp bề mặt đáp ứng với sự tương tác của ba yếu tố bổ sung thêm là MnSO4, MgSO4.7H2O và bột đậu tương đã làm tăng 22,7%hiệu suất thu hồi protein tinh thể trong dịch lên men.
Ngày nay, phương pháp tối ưu môi trường lên men cho vi sinh vật đã và đang được ứng dụng rất rộng rãi do tính đơn giản, hiệu quả của phương pháp. Năm 2013 tác giả Lee và các cộng sự đã sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để tối ưu thành phần môi trường lên men vi khuẩn Bacillussp. LX-1 và đã tìm ra điểm tối ưu giúp nâng hiệu suất thu hồi α-galactosidase 1 lên 6,3 lần so với khi lên men ở điều kiện cơ bản (Lee và cộng sự, 2013). Tác giả Gao và các cộng sự khi sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng cũng đã giúp làm tăng hiệu suất thu hồi laccase lên 59,68 lần khi lên men Trichoderma harzianum ZF-2 (Gao và cộng sự, 2013). Tác giả Linna và các cộng sự khi sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hóa thành phần môi trường lên men cho Paecilomyces tenuipes N45đã làm tăng hiệu suất thu hồi sinh khối, adenosine, polysaccharide và axít cordycep lần lƣợt 8,20; 3,58; 23,17 và 31,51% (Linna và cộng sự, 2012).
Như vậy, môi trường lên men cho vi khuẩn B. thuringiensis từ bã bia có thành phần cụ thể nhƣ sau: dịch thủy phân bã bia (2,5%TS)+ 0,45 g/l MgSO4.7H2O + 0,05 g/l MnSO4+ 3 g/l bột đậu tương.