Kết quả thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà

Một phần của tài liệu Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera) (Trang 133 - 143)

3.4. Nghiên cứu tạo chế phẩm

3.4.2. Kết quả thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà

3.4.2.1. Thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của chế phẩm BT trong phòng thí nghiệm

Để đánh giá hoạt tính sinh học của chủng vi khuẩn MSS8.4 nuôi cấy trên môi trường làm từ dịch thủy phân bã bia đối với ấu trùng ruồi nhà chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với ấu trùng ruồi nhà tuổi 2. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong cùng một điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thông thường, bố trí thí nghiệm như mục 2.3.3.2.4 (chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở Bảng 3.16, hình 3.30.

Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của chế phẩm BT

Chế phẩm 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ

CPĐK l1 C1 0/10 1/10 2/10 2/10 2/10 2/10

C2 0/10 1/10 3/10 4/10 4/10 4/10

C3 2/10 5/10 5/10 5/10 5/10 5/10

C4 0/10 1/10 1/10 1/10 1/10 2/10

C5 0/10 2/10 2/10 4/10 5/10 5/10

CPĐK C1 0/10 0/10 0/10 1/10 1/10 1/10

120

2/4/2014 C2 0/10 3/10 4/10 4/10 6/10 6/10

C3 0/10 0/10 0/10 1/10 2/10 2/10

CPĐK 15/4/2014

C1 0/10 0/10 0/10 2/10 3/10 4/10

C2 0/10 0/10 1/10 2/10 4/10 4/10

C3 1/10 1/10 3/10 3/10 5/10 7/10

C4 0/10 2/10 2/10 5/10 6/10 8/10

C5 0/10 0/10 0/10 1/10 3/10 4/10

Quá quá trình thử hoạt tính cho thấy, những ấu trùng chết do ăn chế phẩm BT có biểu hiện toàn thân có màu đen. Đối với những ấu trùng đã đóng kén mà trước đó có ăn chế phẩm thì kén có màu đen đặc, theo dõi những kén này không có hiện tƣợng nở thành ruồi, điều này chứng tỏ chế phẩm BT có hoạt tính gây chết ngay cả khi ấu trùng đã đóng kén.

Hình 3.30. Thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà của chế phẩm Bt quy mô phòng thí nghiệm

3.4.2.2. Mô hình thử nghiệm chế phẩm BT diệt dòi ruồi nhà quy mô pilot

Sinh khối chủng MSS8.4 sau khi lên men đƣợc thuhồi bằng cách kết tủa, bổ sung phụ gia rồi tiến hành đông khô ở nhiệt độ thấp, áp suất cao thu đƣợc chế phẩm

121 diệt dòi ruồi nhà dạng bột (chỉ tiêu kỹ thuật đạt 4000AI/mg). Tiến hành thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi M. dometisca của chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm. Kế thừa kết quả thử hoạt tính của protein độc tố Cry2 trong phần 3.4.3.1 thành lập các công thức thử nghiệm nhƣ sau:

Công thức 1: 1g bột chế phẩm + 100 ml nước vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

Công thức 2: 1,5g bột chế phẩm + 100 ml nước vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

Công thức 3: 2 g bột chế phẩm +100 ml nước vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

Công thức đối chứng: 100 ml nước vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

Bố trí thí nghiệm: Bột chế phẩm được hòa trong 100 ml nước vô trùng, sau đó trộn đều vào 500 gbã bia, hỗn hợp này đƣợc chứa trong các khay sắt, thả vào mỗi khay 50 ấu trùng dòi tuổi 2, đậy vải màn lên khay để ngăn ruồi ngoài môi trường đẻ trứng vào. Các khay đƣợc đặt ở nhiệt độ 28–350

C. Tỷ lệ ấu trùng ruồi nhà chết đƣợc xác định 5 ngày thử nghiệm, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày ở hình 3.31 và Bảng 3.17:

Bảng 3.17. Hoạt tính diệt ấu trùng ruồi của chế phẩm BTqui mô pilot ST T Công thức

thử nghiệm

Số ấu trùng Musca domestica ban đầu

Tỷ lệ ấu trùng chết sau 5 ngày(%)

1 Côngthức1 150 53,33

2 Côngthức2 150 73,33

3 Côngthức3 150 84,67

4 CôngthứcĐC 150 0,67

122 Hình 3.31. Thử nghiệm hoạt tính diệt ruồi nhà Musca dometisca

Kết quả thử nghiệm cho thấy, hoạt tính diệt ấu trùng ruồi của chế phẩm sinh học BT tương đối cao đạt 53,33 – 84,67% sau 5 ngày thử nghiệm. Kết quả đạt cao nhất (84,67%) khi bổ sung lƣợng chế phẩm là 2 g vào 500 g bã bia. Vì vậy, công thức 3 có thể ứng dụng để thử nghiệm ngoài hiện trường.

3.4.2.3. Chế tạo công thức cho chế phẩm diệt dòi ruồi nhà ngoài thực địa

Từ kết quả nghiên cứu của phần 3.4.3.1 (thử nghiệm chế phẩm Btdiệt dòi ruồi nhà qui mô pilot) thu được công thức 3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nước vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2 hoặc 3 cho hoạt tính cao nhất. Tiến hành thử nghiệm công thức 3 ngoài thực địa với 3 loại giá thể khác nhau phù hợp với điều kiện thực tế:

Công thức 3.1: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nước vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

Công thức 3.2: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nước vô trùng + 500 g phân ủ + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

Công thức 3.3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nước vô trùng + 500 g rác thải hữu cơ + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

Công thức đối chứng: 100 ml nước vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

123 Các công thức đƣợc trộn đều, chứa trong các xô nhỏ, đặt ngoài trời, có phủ vải màn để tránh ruồi ngoài tự nhiên đẻ trứng vào. Kết quả thể hiện trong Bảng 3.18.

Bảng 3.18. Các công thức chế phẩm BT diệt ruồi cho thử nghiệm ngoài thực địa TT

ST T

Công thức thử nghiệm

Số ấu trùng Musca domestica ban đầu

Tỷ lệ ấu trùng chết(%) Sau 3 ngày Sau 5 ngày

1 Công thức 3.1 150 62,33 83,67

2 Công thức 3.2 150 62,67 83,33

3 Công thức 3.3 150 63,33 84,33

4 Công thức ĐC 150 0,67 0,67

Kết quả cho thấy, công thức 3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nước vô trùng + 500 g giá thể + 50 ấu trùng dòi cho tỷ lệ chết tương đương nhau khi thử trên các giá thể khác nhau (phân ủ, rác thải hữu cơ, phế thải nông nghiệp), điều này phù hợp với điều kiện tự nhiên (ấu trùng ruồi có trên nhiều giá thể khác nhau). Vì vậy, công thức 3 thích hợp để ứng dụng ngoài hiện trường.

3.4.2.4. Mô hình thử nghiệm chế phẩm BT diệt dòi ruồi nhà ngoài thực địa Qua khảo sát sự xuất hiện và phát triển các ổ bọ dòi tại các xã thuộc Phủ Lý–

Nam Hà. Chúng tôi tiến hành bố trí mô hình thử nghiệm chế phẩm BT diệt dòi tại 2 xã Đinh Xá và Phù Vân – Phủ Lý – Hà Nam theo mô hình nhƣ sau:

- Xã Đinh Xá thử nghiệm tại khu vực nước thải của chuồng nuôi lợn, bố trí thí nghiệm 1 (TN1) và đối chứng 1 (ĐC1).

- Xã Phù Vân có 2 khu vực thử nghiệm là bể phân ủ của 2 hộ dân: TN2, TN3, ĐC 2, ĐC 3).

Do thực tế ngoài hiện trường số dòi rất nhiều (trung bình 864 con/lít), vì vậy mỗi khu vực thử nghiệm đƣợc bổ sung chế phẩm nhiều hơn so với công thức thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, cụ thể: TN1 là 150 g chế phẩm/m2diện tích bề mặt, TN2 và TN3 là 500 g.

124 Theo dõi hiệu quả của chế phẩm sau 30 ngày. Đối chứng để tự nhiên không dùng chế phẩm. Sau khi bố trí thí nghiệm và thử nghiệm ngoài hiện trường thuộc 2 xã Đinh Xá và Phù Vân – Phủ Lý – Hà Nam thu đƣợc một số hình ảnh và kết quả trình bày trong Bảng 3.19 và Hình 3.32).

Kết quả thử nghiệm đƣợc ghi lại sau mỗi 24 h xử lý cho thấy, tỷ lệ ấu trùng dòi chết tăng theo từng ngày và sau 3 ngày thử nghiệm hiệu quảc ủa chế phẩm đạt 53,3-85,2%, sau 7 ngày tỷ lệ chết đạt 83,7-89%.

Thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm, kết quả thu đƣợc nhƣ sau: sau 30 ngày thử nghiệm tỷ lệ chết đạt 93,1–96,5%. Sở dĩ hiệu quả của chế phẩm vẫn còn cao sau khoảng thời gian dài là do khu vực thử nghiệm nằm riêng biệt, chế phẩm không bị phân tán ra ngoài và do chế phẩm thuộc dạng sinh khối cho nên vikhuẩn B. thuringiensis vẫn tiếp tục phát triển khi gặp môitrường thuận lợi.

Bảng 3.19. Hiệu quả diệt dòi của chế phẩm BT dạng bột thấm ƣớt.

Thí nghiệm

Mật độ dòi ban

đầu (con/lít)

1 ngày 3 ngày 7 ngày 30 ngày

Mật độ dòi (con/lít)

Tỷ lệ chết (%)

Mật độ dòi (con/lít)

Tỷ lệ chết

(%)

Mật độ dòi (con/lít)

Tỷ lệ chết (%)

Mật độ dòi (con/lít)

Tỷ lệ chết

(%)

TN1 663,3 579 12,7 98 85,2 73 89 23 96,5

TN2 1297,3 1143 11.89 428,3 66,98 206.3 84,09 76.3 94,1 TN3 1426,67 1283,3 10 666.3 53,3 232 83,7 98 93,1 ĐC1 216 216 0 208.3 3,56 197.7 8,47 203.3 5,87 ĐC2 412,3 412,3 0 406.3 1,45 400 2,98 420.3 - ĐC3 523,7 523,7 0 511 2,4 498.3 4,85 517.7 1,14

125 Ở các ô đối chứng, mật độ dòi sau 3 ngày, 7 ngày giảm không đáng kể, thậm chí sau 30 ngày còn tăng nhẹ so với sau 7 ngày vì trong các ô đối chứng còn có trứng dòi, sau 30 ngày lại có lứa dòi mới phát triển trong khi số con chết thì rất ít.

Nhƣ vậy, đã bố trí thành công mô hình thử nghiệm chế phẩm diệt dòi ngoài hiện trường, tỷ lệ ấu trùng dòi chết đạt hiệu quả cao từ 83,7-89% tại 2 xã Đinh Xá và Phù Vân – Phủ Lý – Hà Nam. Hiệu quả diệt dòi của chế phẩm sau 30 ngày là 93,1– 96,5%.

Hình 3.32. Thử nghiệm chế phẩm diệt dòi ngoài thực địa

126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Trong số 440 chủng Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt nam, đã sàng lọc và tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS8.4, chủng này có khả năng diệt ấu trùng ruồi nhà Musca dometisca và ấu trùng muỗi cao. Tỷ lệ chết sau 5 ngày đạt 100% với nồng độ 109 CFU/ml.

2. Gen cry2A từ chủng Btk MSS 8.4 đã đƣợc tách dòng, xác định trình tự nucleotide và đăng ký trên GenBank với mã số KM588296.1

3. Khả năng diệt ấu trùng của chủng MSS8.4 có liên quan đến gen cry2A. Gen cry2A đã đƣợc biểu hiện thành công trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). Xác định đƣợc các thông số tối ƣu cho quá trình cảm ứng là: nồng độ IPTG 1mM, nhiệt độ 370C và thời gian là 4 giờ. Tinh sạch đƣợc protein Cry2A tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Probond Nikel Resin.

4. Bã malt bia được tiền xử lý bằng phương pháp axit nhiệt cho hàm lượng các bon, nitơ cao làm nguyên liệu nuôi cấy chủng vi khuẩn Btk MSS8.4 với mật độ tế bào đếm đƣợc đạt 4,9 x 108 CFU/ml.

5.Môi trường bã malt bia thích hợp nhất cho chủng vi khuẩn MSS8.4 sinh tạo độc tố là : dịch thủy phân bã bia (2,5%TS)+ 0,45 g/l MgSO4.7H2O + 0,05 g/l MnSO4+ 3 g/l bột đậu tương. Ở môi trường này tổng tế bào, bào tử, nồng độ deltaendotoxin lần lƣợt đạt 4,5x108 CFU/ml, 4,3x108 CFU/ml và 529,11 mg/l.

6. pH ban đầu từ 6,5-7,5, nhiệt độ 300C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thời gian lên men 72 h là điều kiện thích hợp nhất để lên men sản xuất chế phẩm BT. Chế phẩm thu đƣợc có hiệu quả xử lý diệt ấu trùng ruồi nhà ngoài thực địa khá cao, từ 93,1 đến 96,5%.

127 KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu về khả năng diệt ấu trùng rồi nhà của protein tái tổ hợp pCry2A.

2. Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT trên môi trường Dịch thủy phân bã bia ở quy mô lớn hơn.

3. Nghiên cứu sâu hơn về tính ổn định, các yếu tố khách quan ảnh hưởng đến chất lượng của chế phẩm cũng như sự tồn dư của chế phẩm BT ngoài môi trường sinh thái.

128 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Phạm Thùy Dương, Ngô Đình Bính, Lê Đức Khánh, Nguyễn Thị Hòa, Chu Kỳ Sơn (2017), Tối ưu thành phần môi trường lên men từ dịch thủy phân bã thải nhà máy bia làm môi trường lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis sinh protein diệt ruồi nhà„. Tạp chí Bảo vệ thực vật,4 (273): tr.35-41

2.Phạm Thùy Dương, Ngô Đình Bính, Lê Đức Khánh, Nguyễn Thị Hòa (2017),

Xử lý bã thải của ngành công nghiệp sản xuất bia thành môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 sinh độc tố diệt ruồi nhà„.

Tạp chí An toàn-sức khỏe và môi trường lao động, 1, 2& 3: tr. 34-40

3.Phạm Thùy Dương, Ngô Đình Bính, Trịnh Thị Thu Hà,Lê Đức Khánh (2017),

Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4. Tạp chí Công nghệ Sinh học,15(3): tr. 563-569.

4.Ngô Đình Bính, Đặng Văn Tiến, Phạm Thùy Dương, Trịnh Thị Thu Hà, Lê Thị Minh Thành(2018), Chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki MSS 8.4 và chế phẩm diệt ruồi nhà Musca Domestica chứa dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn này. Bằng giải pháp hữu ích số 2-0001783-Cục sở hữu trí tuệ.

Một phần của tài liệu Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera) (Trang 133 - 143)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(177 trang)