CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Chủng B. thuringiensis phân lập đƣợc đƣợc đem cấy thảm trên đĩa peptri chứa môi trường MPA và nuôi trong tủ ấm 28oC trong 3-4 ngày sau đó thu lại toàn bộ sinh khối. Sinh khối đƣợc xử lý nhiệt ở 700C trong 10 phút. Dịch đã xử lý nhiệt đƣợc pha loóng ở cỏc nồng độ 10-6 đến 10-9, lấy 100 àl mỗi nồng độ pha loóng được cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trường MPA. Nuôi ở 280C sau 24h đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng nhỏ nhất. Số lƣợng bào tử đƣợc tính theo công thức (Ohba và cộng sự, 1986)
CFU= n.a.10
n : Số khuẩn lạc trung bỡnh tạo thành trong 100 àl dịch pha loóng.
a : nồng độ pha loãng.
2.3.2.2. Xác định LC50 đối với côn trùng thử nghiệm
51 Chuẩn bị mẫu protein tinh thể hòa tan
Các chủng B. thuringiensiscó hoạt tính diệt ấu trùng ruồi cao mang đoạn gen cry2A đã đƣợc phân lập đem nuôi lắc qua đêm 200 vòng/phút ở 28oC trong môi trường LB. Cấy chuyển một lượng dịch nuôi sang bình tam giác 500 ml chứa 100 ml môi trường LB, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 4 ngày. Dịch lên men được ly tâm ở 10.000 vòng trong 10 phút ở 40C, thu cặn. Tủa này gồm hỗn hợp tất cả bào tử, protein tinh thể diệt côn trùng, mảnh tế bào và các thể rắn đƣợc hòa tan.
Phương pháp tách chiết protein tinh thể
Dịch huyền phù đƣợc ly tâm ở 13.000 vòng trong 10 phút ở 40C. Loại bỏ cặn có chứa bào tử, mảnh tế bào và các thể rắn đƣợc hòa tan.
Xác định nồng độ protein tinh thể diệt côn trùng (nội độc tố) bằng cách rửa cặn 3 lần với 1ml dung dịch 0,14M NaCl 0,01% Triton X-100 nhằm loại bỏ các protein hòa tan và protease, nó kết chặt gây ảnh hưởng đến độ tinh sạch của protein tinh thể sau khi ly tâm.
Bổ sung 1ml NaOH 0,05M (pH = 12,5) lắc và ủ trong 3 giờ cho tan kết tủa.
Dịch đã ủ sau 3 giờ đƣợc ly tâm 13.000 vòng trong 10 phút ở 40C. Thu dịch nổi có chứa các protein tinh thể diệt côn trùng hòa tan trong kiềm. Xác định nồng độ nội độc tố bằng phương pháp Bradford sử dụng albumin huyết thanh bò như protein chuẩn (Binh và cộng sự, 1995).
Xác định hàm lượng protein tinh thể
Các protein tổng số và tái tổ hợp trong nghiên cứu đƣợc định lƣợng bằng phương pháp Bradford (1976).
Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp này là các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine trong chuỗi polypeptide khi kết hợp với Coomassie Brillant Blue G-250 sẽ hình thành phức hợp màu xanh dương có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein và hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị đường chuẩn
52 Cách thực hiện: xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein albumin huyết thanh bò (BSA) đã biết nồng độ. Sau đó cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máyquang phổ kế (Spectrophotometer) ta đƣợc ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng proteintrong mẫu.Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 595 nm của các mẫu đối chiếu với đường chuẩn của albumin huyết thanh bò để tính ra lượng protein có trong mẫu.
2.3.2.3. Thử hoạt tính trên côn trùng thử nghiệm
*/Thử hoạt tính đối với ấu trùng ruồi nhà, ấu trùng ruồi đục quả
Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tƣợng ấu trùng ruồi nhà Muscadomestica và ấu trùng ruồi đục quả tuổi hai theo phương pháp của Thiery và Frachon ở hai nồng độ là 107 và 109 bào tử/ml. Mỗi nồng độ đƣợc thử nghiệm với 3 cốc nhựa (mỗi cốc 10 ấu trùng).
Tỉ lệ ấu trùng chết đƣợc tính theo công thức Abbott (Abbott, 1925):
A=(C-T).100/C Trong đó: A: % ấu trùng chết.
C: Số ấu trùng sống ở mẫu đối chứng.
T: Số ấu trùng sống ở mẫu thí nghiệm.
*/ Thử hoạt tính đối với ấu trùng muỗi
Hút vào mỗi cốc đã đƣợc lau sạch bằng cồn 99 ml H2O cất và 30 ấu trùng muỗi/cốc và cho một ít thức ăn để nuôi ấu trùng. Pha loãng các chủng Bt phân lập đƣợc ở các nồng độ 108 và 106 bào tử/ml cho vào mỗi cốc thử nghiệm. Các mẫu thí nghiệm để ở nhiệt độ 200-250C và đặt ở nơi thoáng mát tránh ánh nắng, theo dõi tỉ lệ ấu trùng muỗi chết sau 6, 12, 18, 24 giờ.
Đối chứng: Dùng cốc chứa 100ml H2O cất và 20 con ấu trùng muỗi mỗi cốc.
53 Làm 3 mẫu đối chứng cho mỗi loại muỗi. Theo dõi các thời gian như bình thường.
Tỉ lệ ấu trùng muỗi chết được tính theo phương pháp đã chỉ ra ở trên.