CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4. Tối ưu hóa môi trường lên men theo phương pháp đáp ứng bề mặt
Một vòng que cấy vi khuẩn B.thuringiensistừ ống giống đƣợc đƣa vào bình tam giác 500ml có chứa 100 ml môi trườngMTCS vô trùng. Nuôi lắc ở 30oC, 200 vòng/phút, thời gian nhân giống 8-10 giờ. Dịch nuôi cấy (chứa các tế bào đang ở giai đoạn sinh trưởng) được sử dụng để làm giống cho các thí nghiệm tiếp theo (Adjiable và cộng sự, 2009; Yezza và cộng sự, 2006).
2.3.4.2. Phương pháp lên men vi sinh vật
*/ Lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong bình tam giác
Sử dụng tam giác 500 ml chứa 100 ml môi trường vô trùng bổ sung 1% dịch giống. Lên men trong máy lắc ổn nhiệt ở 30±0,1oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thời gian nuôi 48h (Yezza và cộng sự, 2006).
*/ Lên men trong thiết bị lên men 10 lít
Đưa 10 lít môi trường vào bình lên men, khử trùng ở 121oC, 1 at, trong vòng 30 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng, lắpbình lên men vào thiết bị lên men. Cài đặt các thông số lên men: nhiệt độ 30±0, 1oC, pH7±0,1, tốc độ khuấy 300 vòng/phút, DO>25 mg/l, tốc độ thổi khí 2-4 lít/phút (Lương Đức Phẩm, 2008; Avigone và cộng sự, 1992)
2.3.4.3. Thủy phân bã bia
61 Bã bia sau khi lấy về phòng thí nghiệm đƣợc xay nhỏ và xử lý làm nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp nhiệt phân kết hợp thay đổi pH (Nguyễn Thị Vân Trang và cộng sự, 2012; Valo và cộng sự, 2004)
Nguyên tắc chung
Sử dụng nhiệt kết hợp với tác nhân kiềm mạnh để phá hủy các cấu trúc phức tạp trong các hợp chất hữu cơ cao phân tử thành các cấu tử đơn giản có khả năng hòa tan vào nước đồng thời phá vỡ cấu trúc thành tế bào của các tế bào nấm men trong bã bia giải phóng các chất dinh dƣỡng trong tế bào vào pha lỏng làm nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho vi sinh vật phát triển.
Các bước thực hiện
Bước 1: Sử dụng H2SO4 5 M để điều chỉnh pH của dịch bã bia về pH2.
Bước 2:Thủy phân môi trường ở 121oC, áp suất 1atm, thời gian 30 phút.
Bước 3: Làm nguội, điều chỉnh pH về 7 bằng NaOH10M đã vô trùng bằng giấy lọc vô khuẩn.
2.3.4.4. Bố trí thí nghiệm
*/ Ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý bã bia đến sinh trưởng, hình thành bào tử và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4
Bã bia sử dụng trong các thí nghiệm đƣợc lấy ở nhà máy bia Sài Gòn - Hà Nội đƣợc nghiền nhỏ bằng cối xay sinh tố, điều chỉnh về 2,5%TS (TS: Tổng chất rắn), tiến hành thí nghiệm nhƣ sau:
TN1: Môi trường MTCS được khử trùng ở 121oC trong 30 phút (đối chứng) TN2: Bã bia đƣợc khử trùng ở 121oC trong 30 phút, sau đó điều chỉnh về pH 7 bằng NaOH 10M.
TN3: Bã bia đƣợc điều chỉnh về pH 2 bằng H2SO4 5M rồi khử trùng ở 121oC trong 30 phút, sau đó điều chỉnh về pH 7 bằng NaOH 10M.
TN4: Bã bia đƣợc điều chỉnh về pH 10 bằng NaOH 10M rồi khử trùng ở 121oC trong 30 phút, sau đó điều chỉnh về pH 7 bằng H2SO4 5M.
Dịch thủy phân bã bia sau xử lý đƣợc đƣa đi phân tích thành phần hóa học theo các phương pháp tiêu chuẩn. Trong đó TOC được xác định bằng phương pháp
62 SMEWW 5310B-2005; TN, TP được xác định bằng phương pháp EPA-352.1 và EPA-365.2, thành phần kim loại được xác định theo phương pháp SMEWW 3125- 2005. (Adjiable và cộng sự, 2009)
*/ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất rắn lên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4
Bã bia sau khi nghiên nhỏ đƣợc điều chỉnh về các giá trị: 1%TS, 1,5%TS, 2%TS, 2,5%TS, 3%TS, 3,5%TS để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ TS đến hiệu quả lên men MSS8.4.
Các mẫu thí nghiệm đƣợc tiến hành đồng thời với một mẫu đối chứng (sử dụng môi trường cơ sở). Thí nghiệm được tiến hành lên men trong bình tam giác ở điều kiện 30oC, thời gian 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút.
*/ Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia
Dịch thủy phân bã bia sau khi xử lý bằng phương pháp axit nhiệt được điều chỉnh về pH 7. Bổ sung độc lập các nguồn dinh dưỡng dưới đây:
- Muối khoáng: MgSO4.7H2O; CaCl2; KH2PO4; K2HPO4; NaCl, MnCl. Nồng độ khảo sát 0,1 g/l; 0,5 g/l; riêng MnSO4 ở nồng độ 0,01 và 0,05 g/l.
- Chất hữu cơ: bột đậu tương, cám gạo, bột ngô (nồng độ khảo sát 1 g/l và 3 g/l).
Các môi trường sau khi đã bổ sung nguồn dinh dưỡng được vô trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút.
*/ Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng và sinh protein tinh thể
Nguồn dinh dƣỡng đƣợc chọn để bổ sung vào dịch thủy phân bã bia bao gồm:
MnSO4, MgSO4.7H2O và bột đậu tương. Nồng độ khảo sát được thực hiện cụ thể nhƣ sau:
-MgSO4.7H2O(g/l): 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0.
- MnSO4(g/l) : 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,1 - Bột đậu tương (g/l): 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 7,0; 10,0.
- Mẫu đối chứng: dịch thủy phân bã bia bằng phương pháp axit nhiệt.
Các môi trường sau khi bổ sung các chất dinh dưỡng được vô trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút.
63
*/ Tối ưu hóa thành phần môi trường bằng phương pháp đáp ứng bề mặt
Tối ưu thành phần môi trường theo phương pháp đáp ứng bề mặt được mô tả được thực hiện theo phương pháp của Rajesh và cộng sự (2012).Sau khi xác định được khoảng tác động của từng yếu tố đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protein của MSS8.4, nhập dữ liệu vào phần mềm Design expert 10.1, phần mềm đƣa ra 20 thí nghiệm nhƣ bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các thí nghiệm đƣợc thiết kế bởi phần mềm Design expert 10.1 STT
Nồng độ bổ sung (g/l)
Bột đậu tương MnSO4. MgSO4.7H2O
1 5 0 0,8
2 6,36 0,05 0,45
3 3 0,134 0,45
4 1 0,1 0,8
5 3 0,05 0,45
6 1 0 0,8
7 5 0,1 0,1
8 3 0,05 0
9 3 0,05 0,45
10 3 0,05 1,038
11 3 0,05 0,45
12 5 0 0,1
13 5 0,1 0,8
14 1 0,1 0,1
15 3 0,05 0,45
16 3 0 0,45
1 0 0,05 0,45
18 1 0 0,1
19 3 0,05 0,45
20 3 0,05 0,45
64 Thí nghiệm đƣợc thực hiện ở bình tam giác với thể tích 50 ml môi trường/bình 250 ml. Các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ba lần trong cùng một điều kiện, lấy số liệu trung bình của 3 lần thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Design expert 10.1
*/ Xử lý số liệu
Tập hợp dữ liệu định lƣợng nhận từ thiết kế các yếu tố, nhằm giải quyết đồng thời sự tác động của các yếu tố bằng phương trình đa biến. Các thành phần môi trường đã lựa chọn có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Bt đƣợc tối ƣu hóa sử dụng thiết kế phức hợp tại tâm điểm. Theo thiết kế này, tổng số các phương án xử lý là 2k+2k+n0. Trong đó “k” là biến số độc lập, n0 là số thí nghiệm lặp lại ở tâm. Sử dụng quy hoạch trực giao đối xứng cho ba yếu tố tác động (nồng độ Ca, Mg và cám gạo) phần mềm Design expert 10.1cho ra 20 thí nghiệm.
Các biến Xi đƣợc mã hóa là xi theo phép biến đổi sau:
xi = Xi – X0/δX
Trong đó xi là giá trị được mã hóa vô hướng của biến số Xi, X0 là giá trị của Xi tại tâm điểm và δX là bước thay đổi (bước nhảy). Để tối ưu hóa thành phần môi trường người ta sử dụng thiết kế có k yếu tố. Phương trình tối ưu các thành phần môi trường được đưa ra dựa trên cơ sở của phương trình bậc hai sau:
Y = β0 + ∑βixi + ∑βiixi2 + ∑βijxj
Trong đó Y là kết quả dự đoán, β0 là giới hạn bị chặn, βi là ảnh hưởng tuyến tính, βii là ảnh hưởng bậc hai và βij là sự tương tác qua lại.
Kết quả đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Design expert 10.1để phân tích các hệ số hồi quy, bề mặt đáp ứng và tối ƣu hóa với thuật toán “hàm mong đợi”.