3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis
3.1.2. Nghiên cứu protein tinh thể
Các chủng B. thuringiensis có khả năng sinh ra các dạng tinh thể: hình cầu, hình lưỡng tháp, hình lập phương, hình không xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau.
Hình 3.4. Hình ảnh tinh thể của các chủng Bt phân lập tại Việt Nam chụp bằng kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10000 lần.
A: Hình lưỡng tháp; B: Hình lưỡng tháp và hình lập phương; C: Hình cầu; D:
Hình lập phương và hình cầu; E: Hình lưỡng tháp, lập phương và hình cầu; F: Hình lưỡng tháp, lập phương và hình không xác định
440 chủng B. thuringiensisđã phân lập thuộc 7 vùng địa lý của Việt Nam được tiến hành nuôi cấy trên môi trường MPA. Sau 3 ngày quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm bằng thuốc nhuộm fushin để xác định hình dạng tinh thể của các chủng vi khuẩn.
A B C
D E F
70 Hình 3.5.Kết quả phân loại hình thái tinh thể của B. thuringiensis trong các
mẫu đất, lá thuộc 7 vùng của Việt Nam.
Kết quả Hình 3.4 và 3.5 cho thấy, tất cả các chủng phân lập có khả năng sinh tinh thể ở tất cả các hình dạng. Có những chủng có khả năng sinh từ 1 – 3 loại tinh thể. Cụ thể, 186/440 chủng sinh tinh thể hình lƣỡng tháp (42,2%); 193/440 chủng sinh tinh thể hình cầu (43,8%); 46/440 chủng sinh tinh thể hình lập phương (10,5%);
15/440 chủng sinh tinh thể hình không xác định (3,5%).
Nghiên cứu về hình dạng tinh thể của các chủng B. thuringiensis phân lập tại tỉnh Thành Đô – Trung Quốc có dạng hình tháp lƣỡng cực và hình cầu, chiếm tới 91,8% (Yu và cộng sự, 2015). Tuy nhiên, phần lớn cấu trúc tinh thể của các chủng B. thuringiensis thu thập tại bang Tamil Nadu - Ấn Độ có dạng hình lập phương (26,9%) và hình tháp lƣỡng cực (21,2%) (Ramalakshmi và Udayasuriyan, 2010).
Kết quả quan sát hình dạng tinh thể của các chủng Bt thu thập ở Saudi Arabia kết luận, cấu trúc tinh thể dạng cầu chiếm tỉ lệ lớn (54%), sau đến là dạng không định hình (27%) và tháp lƣỡng cực (16%) (El-kresh và cộng sự, 2014). Sự đa dạng và khác biệt về hình dạng tinh thể của các chủng phân lập đƣợc trong nghiên cứu này cũng nhƣ trong các nghiên cứu khác có thể do sự khác nhau về đặc điểm sinh học của các chủng B. thuringiensis cũng nhƣ đặc điểm protein Cry của các chủng thu thập đƣợc.
71 Theo các tài liệu công bố trên thế giới, các chủng mang gen cry2A rất đa dạng chúng có thể sinh ra từ các dưới loài Bt. serovar kurstaki,Bt. serovar sotto, Bt.serovar israelensis, Bt. serovar kenyae có hình dạng tinh thể chủ yếu là hình cầu và hình lƣỡng tháp. Vì vậy, các chủng có khả năng sinh ra tinh thể hình cầu và hình lƣỡng tháp đƣợc lựa chọn để nghiên cứu phân loại và sàng lọc gen cry2A bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch.
3.1.3. Phân loại các chủng B. thuringiensis phân lập
Vi khuẩn B. thuringiensis được chia ra làm rất nhiều dưới loài khác nhau, mỗi dưới loài mang các đặc điểm riêng biệt. Cho đến nay, có ít nhất 82 dưới loài B.
thuringiensis đã đƣợc phát hiện dựa trên phản ứng miễn dịch với kháng nguyên H (Horani và cộng sự, 2003; Joung và Côte’; 2001; Lecadet và cộng sự, 1999; Roh và cộng sự, 2009). Theo các tài liệu đã được công bố trên thế giới,các dưới loài Bt.
kurstaki, Bt. tolwwarthi , Bt. sotto, Bt. israelensis, Bt. kenyae... có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh. Từ các chủng vi khuẩn B. thuringiensis phân lập đƣợc có khả năng sinh tinh thể hình cầu và hình lƣỡng tháp, lựa chọn đƣợc 45 chủng để phân loại bằng kít huyết thanh miễn dịch.
Với kít huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật cho 60 dưới loài B. thuringiensis khác. Thông qua phản ứng ngưng kết với các typ huyết thanh, xác định đƣợc 32 chủng B. thuringiensis (chiếm 71%), trong đó có 5 chủng thuộc dưới loài Bt. serovar. kurstaki, 2 chủng Bt. serovar israelensis (Bảng 3.1). Các chủng còn lại không ngưng kết với các huyết thanh hiện có trong bộ sưu tập của phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học. Nguyên nhân có thể chúng thuộc các dưới loài còn lại hoặc là dưới loài mới.
72 Hình 3.6. Hình ảnh ngƣng kết của chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết thanh
dưới kính hiển vi quang học.
A: Trước khi nhỏ huyết thanh miễn dịch
B: Sau khi nhỏ huyết thanh miễn dịch typ 3a,3b
Bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch, xác định được 7 chủng thuộc 2 dưới loài Bt. serovar. kurstaki, Bt. serovar israelensis. Các chủng này sẽ đƣợc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học với ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) và sàng lọc gen cry2A.
Bảng 3.1. Kết quả phân loại dưới loài các chủng Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh
STT Dưới loài Bacillus thuringiensis Typ huyết thanh
Số chủng ngƣng kết
Tỷ lệ (%) 1 Bacillus thuringiensisserovar israelensis 14 2 6,25 2 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki 3a,3b 5 15,62 3 Bacillus thuringiensisserovar
sumiyoshiensis
3d 9 28,13
4 Bacillus thuringiensisserovar coreanensis 25 4 12,5 5 Bacillus thuringiensisserovar neoleonensis 24a, 24b 2 6,25
6 Bacillus thuringiensisserovar aizawai 7 5 15,63
7 Bacillus thuringiensisserovar yunnanensis 20a, 20b 1 3,13 8 Bacillus thuringiensisserovar pakistani 13 3 9,38 9 Bacillus thuringiensisserovar oswaldocruzi 38 1 1,39 Tổng số chủng phản ứng dương: 32 chủng chiếm 71,11%
Số chủng phản ứng âm: 13 chủng chiếm 28,89%
73 Nghiên cứu của Martinez và cộng sự (2005) cho thấy, gen cry2 xuất hiện ở tất cả các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki. Ngoài ra, chủng B. thuringiensis serovar israelensis cũng được tìm thấy phổ biến ở các môi trường sống của muỗi (Martinez và Caballero, 2002). Do đó, các chủng thuộc nhóm này sẽ đƣợc đề tài lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4.Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập Để thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) của các chủng B.
thuringiensis thuộc dưới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis serovar israelensis ta pha loãng nồng độ bào tử đến mức 109 bào tử/ml và thử nghiệm với ấu trùng ruồi nhà tuổi hai, ấu trùng muỗi và ấu trùng ruồi đục quả.
Phương pháp thử hoạt tính diệt ấu trùng đã mô tả trong phần 2.3.3.
Tỷ lệ ấu trùng chết đƣợc tính sau 3 và 5 ngày thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ 2 cánh của các chủng B. thuringiensis sau 3 và 5 ngày thử nghiệm
Tên chủng Bacillus thuringiensis
Thử nghiệm với ấu trùng muỗi
Thử nghiệm với ấu trùng ruồi nhà
Thử nghiệm với ấu trùng ruồi đục quả Tỉ lệ chết
sau 3 ngày (%)
Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%)
Tỉ lệ chết sau 3 ngày (%)
Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%)
Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%)
Tỉ lệ chết sau 7 ngày (%)
LD 2.21 66,67 90,33 83,33 100
LNT 7.12 66,67 96,67 83,33 100 16,67 33,33
LNT 16.6 73,33 83,33 86,67 100 13,33 16,67
MSS 1.1 50 100 66,67 83,33 3,33 10
MSS 4.2 46,67 78,67 60 76,67 0 10
MSS 6.3 63,33 98,33 80 100 13,33 20
MSS 8.4 80 100 93,33 100 20 33,33
74
4D4 6,67 30 16,67 30 0 0
Kết quả thử ấu trùng cho ta thấy, các chủng B. thuringiensis đƣợc tuyển chọn có khả năng diệt ấu trùng khá cao. Tỷ lệ ấu trùng chết tăng dần theo thời gian thí nghiệm. Ở nồng độ 109 bào tử/ml các chủng đƣợc lựa chọn có tỷ lệ ấu trùng chết đạt 76,67 - 100 % sau 5 ngày. Tuy nhiên, khả năng diệt ấu trùng ruồi đục quả là tương đối thấp, chỉ đạt 0 – 33,33% sau 7 ngày thử nghiệm.
Trong số các chủng phân lập đƣợc, chủng LNT 7.12 và MSS 8.4 cho khả năng diệt ấu trùng cao. Do vậy, 2 chủng này đƣợc nghiên cứu sâu hơn về gen cry2A để có thể xác định sự có mặt của gen cry2A có liên quan đến khả năng diệt ấu trùng hay không và nghiên cứu tạo chế phẩm diệt bộ hai cánh.
3.2. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng bộ hai cánh ở các chủng phân lập
3.2.1. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh bằng phương pháp PCR
Để khẳng định khả năng diệt ấu trùng bộ hai cánh ở 2 chủng có khả năng diệt ấu trùng ruồi nhà tốt nhất có phải đƣợc quy định bởi gen cry2A hay không, đề tài tiến hành phân lập gen cry2Atừ hai chủng này và nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp, đánh giá khả năng diệt ấu trùng của protein Cry2A tái tổ hợp.
Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen cry2A sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế dựa vào các đoạn bảo thủ của gen cry2A đã đƣợc công bố trên ngân hàng thu đƣợc sản phẩm có chiều dài 1902 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
Theo các nghiên cứu trước, các chủng mang tinh thể hình thoi có thể có mặt của gen cry1. Kết quả sàng lọc bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1 cũng thể hiện, 7 chủng nghiên cứu có sự xuất hiện của gen cry1 (kết quả không được thể hiện). Kết quả phát hiện gen cry2A bằng phương pháp PCR cho thấy, 7 chủng thuộc 2 dưới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis
75 serovar israelensis đều cho sản phẩm PCR có 1 băng với kích thước khoảng 1,9 kb (Hình 3.7).
76 Hình 3.7. Kết quả PCR sàng lọc các 7 chủng B. thuringiensis bằng cặp mồi
khuếch đại gen cry2A
1: LD 2.21; 2: LNT 7.12; 3: LNT 16.6; 4: MSS 1.1; 5: MSS 4.2; 6: MSS 6.3; 7:
MSS 8.4; M: Thang DNA chuẩn (HighRanger, Norgenbiotek)
Trong nghiên cứu này, đề tài kiểm tra sự có mặt từ gen cry2A từ 7 chủng, gen cry2A từ 2 chủng có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà cao nhất đƣợc giải trình tự.
3.2.2. ách dòng và đọc trình tự gen cry2A
Gen cry2A từ hai chủng có hoạt tính diệt ruồi cao nhất đƣợc khuếch đại vàgắn vào vector tách dòng PCR2.1, biến nạp vào tế bào E. coliDH5α.
Sau 14 - 16 giờ cấy trải lờn mụi trường chọn lọc LB, Ampicilin 50 àg/ml, ở 37oC, tiến hành sàng lọc sơ bộ bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Từ 4 dòng tế bào mang gen của mỗi chủng sàng lọc bằng cặp mồi đặc hiệu, đều thu đƣợc đoạn kích thước đúng như tính toán (khoảng 1,9 kb) (Hình 3.8).
Hình 3.8. Kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc, các dòng biến nạp gen cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4
77 1-4: Sản phẩm PCR dòng biến nạp gen từ chủng LNT7.12; 5-8: Sản phẩm PCR
dòng biến nạp gen từ chủng MSS8.4; 9: Đối chứng âm; M: Thang DNA chuẩn (HighRanger, Norgenbiotek)
Để khẳng định lại kết quả, 3 dòng tế bào mang gen đƣợc mang đi nuôi lắc và tách DNA plasmid. Plasmid sau khi tách và tinh sạch đƣợc cắt bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và XhoI, chính là 2 enzyme đƣợc treo sẵn trình tự nhận biết khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân gen. Nếu vector mang gen chèn sẽ xuất hiện 2 băng trên gel điện di, băng 1,9 kb chính là gen cry2A và băng 3,9 kb chính là kích thước của vector pCR2.1.
Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid của 3 dòng tế bào đều cho 1 băng có kích thước 3,9 kb và 1 băng có kích thước 1,9 kb, đúng như kích thước tính toán. Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,9 kb đã đƣợc tách dòng thành công (Hình 3.9).
Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác gen tách dòng có phải là là gen cry2A hay không, trình tự đoạn gen này đƣợc đọc và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm chuyên dụng.
Hình 3.9. Kết quả cắt các dòng biến nạp mang gen cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4 bằng 2 enzyme BamHI,XhoI
1: DNA plasmid không cắt; 2-4: Sản phẩm cắt các dòng mang gen từ chủng LNT7.12; 5-7: Sản phẩm cắt các dòng mang gen từ chủng MSS8.4; M: Thang DNA
chuẩn (HighRanger, Norgenbiotek)
78 Từ 3 chủng đã tách dòng và sàng lọc thành công của mỗi dòng, DNA plasmid của các dòng đƣợc gửi đi đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự tự động (Macrogen, Hàn Quốc) sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Trình tự nucleotide sau khi đọc trình tự đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit ver 7.0.9. Các trình tự DNA này sau đó đƣợc so sánh và xác định mối quan hệ với các trình tự gen cry khác trên Ngân hàng Gen Quốc tế.
Cho đến nay, dựa trên trình tự gene mã hoá, độc tố Cry đã đƣợc chia thành ít nhất 70 nhóm, trong đó phổ biến và đƣợc ứng dụng nhiều nhất là các nhóm Cry1, Cry2, Cry3, Cry4 (Bravo, 1997; Bravo và cộng sự, 2012; Crickmore và cộng sự, 1998). Trong nghiên cứu này, đề tài tiến hành xây dựng mối quan hệ di truyền của trình tự gene cry2A thu thập đƣợc với các trình tự tham chiếu nhằm xác định phân nhóm của trình tự gene tổng hợp. Sự sai khác về trình tự axit amin giữa các nhóm gene Cry lên tới 60%, trong khi sự sai khác giữa các phân nhóm nằm trong khoảng từ 30 - 60% (Bravo và cộng sự, 2013). Sự tương đồng về trình tự axit amin giữa các nhánh giao động trong khoảng 5 - 30%. Kết quả xây dựng cây phả hệ cho thấy trình tự thu đƣợc mã hoá cho gene thuộc nhóm cry2A, phân nhóm cry2Aa (Hình 3.10).
Nhóm độc tố cry2Aa và cry4 đã đƣợc chứng minh có khả năng gây độc lên côn trùng thuộc bộ 2 cánh (Bravo, 1997).
79 Hình. 3.10. Phân nhóm quan hệ của trình tự DNA phân lập từ chủng MSS8.4
với các trình tự gen cry.
Trình tự DNA của của các gen cry2Aa này tiếp tục đƣợc căn đa chuỗi so sánh với các trình tự gen thuộc phân nhóm cry2Aa trên Ngân hàng Gen Quốc tế.
Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 có chiều dài 1902 bp và có độ tương đồng là 99% với trình tự tương ứng đã công bố trước đây trên ngân hàng genvới 6 điểm sai khác: 305 (G-A), 500 (G-A), 783 (T-G), 1054 (T-G), 1303 (G-A), 1575 (C-T) ( chi tiết tại Hình 3.11), chủng LNT7.12 có độ tương đồng 100%
với chủng công bố.Trình tự nucleotide của gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 đƣợc đƣa lên Genbank với mã số là KM588296.
AJ132465.1_Cry2Aa6 AF047038.1_Cry2Aa4 M31738.1_cry2Aa1 M23723.1_Cry2Aa2
LNT7.12 MSS8.4
AJ132464.1_Cry2Aa5 D86064.1_Cry2Aa3 M23724.1_Cry2Ab1 X55416.1_Cry2Ab2
X57252.1_Cry2Ac1 M11250.1_Cry1Aa
M13898.1_Cry1ab M11068.1_Cry1ac J02978.1_Cry3aa
U31633.1_Cry3bb Y00423.1_Cry4aa1 D00248.1_Cry4aa2 D00247.1_Cry4ba4 X07423.1_Cry4ba1 X07082.1_Cry4ba2
M20242.1_Cry4ba3
9 3 1 0 0
1 0 0
6 0 7 1 1 0 0 1 0 0
9 4
8 2
1 0 0 1 0 0
6 2 1 0 09 9
9 9
0.1
80
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 ATGA ATA ATGTAT TGA ATAGTG GA AGA ACA ACTAT T TGTGATGCGTATA ATGTAGTAGC C CATGATC CAT T TAGT T T TGA ACATA A ATCAT TAGATAC CATC CA A A A AGA ATG GATG GAG M31738.1_cry2Aa1 .... ... ...... ... ...... .. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... M23723.1_Cry2Aa2 .... ... ...... ... ...... .. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... D86064.1_Cry2Aa3 .... ... ...... ... ....C. .. . A . ... ..... . ...A ......... .......G ..T..C.... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. .G. ... ... .... ... AF047038.1_Cry2Aa4 .... ...G..... ... ...... .. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... AJ132464.1_Cry2Aa5 .... ... ...... ... ....C C.. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... AJ132465.1_Cry2Aa6 .... ... ...... ... ....C. .. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... M23724.1_Cry2Ab1 .... ...G..... ... ....C. .. ... ..T..... . ............. ......CG ..T....... ... . .... . . .C. ...C. . ..... ....... .G.A.. . . .G .. ... ..C. ... X55416.1_Cry2Ab2 .... ...G..... ... ....C. .. ... ..T..... . ............. ......CG ..T....... ... . .... . . .C. ...C. . ..... ....... .G.A.. . . .G .. ... ..C. ... X57252.1_Cry2Ac1 .... ...C..... ... ... AC. .. ... . AT....C. ...C....AC... ....... T..T....... ... . .... . . ... ..... . ..... .. A .... ...AG. . . . ... ... .. A A.. A
130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 TG GA A A AGA ACAGATCATAGT T TATATGTAGCTC CTGTAGTCG GA ACTGTGTCTAGT T T T T TGCTA A AGA A AGTG G G GAGTCT TAT TG GA A A A AG GATAT TGAGTGA AT TATG G G G GATA M31738.1_cry2Aa1 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... M23723.1_Cry2Aa2 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... D86064.1_Cry2Aa3 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . .C..... . ... . .... . . ......A .. .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .T .. AF047038.1_Cry2Aa4 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... AJ132464.1_Cry2Aa5 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... AJ132465.1_Cry2Aa6 .. ..G. ... ............ . ............ ......... .. ............ . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... M23724.1_Cry2Ab1 .. .. . . . A . . ATA ........ . ....C C...A.. ..A. T.. T. .. ...... G..... . . .C..T .. . ... . .... . . ...... .G. .. .. . . . .. ....C.A .....G. ..C. .A AT T .. X55416.1_Cry2Ab2 .. .. . . . A . . ATA ........ . ....C C...A.. ..A. T.. T. .. ...... G..... . . .C..T .. . ... . .... . . ...... .G. .. .. . . . .. ....C.A .....G. ..C. .A AT T .. X57252.1_Cry2Ac1 .. .. . . ... ..T......... . .......... C . ..A. T..G . .. ...... G G.... . . .C.AT .. . ... . ...A. . ...... .G. .. .. . . . .. ....C.......G. ..CA.A AT T ..
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 ATAT T TC CTAGTG GTAGTACA A ATCTA ATGCA AGATAT T T TA AG G GAGACAGA ACA AT TC CTA AGTCA A AGACT TA ATACAGATAC C CT TGCTCGTGTA A ATGCAGA AT TGATAG G GCTC M31738.1_cry2Aa1 .... . .. ...... ........ . ..... ..... ...... . . .. .. . ........ ... .. .. ... . A... . ..... .. .......... . .. .......... . ....... .. ...... . .... M23723.1_Cry2Aa2 .... . .. ...... ........ . ..... ..... ...... . . .. .. . ........ ... .. .. ... . A... . ..... .. .......... . .. .......... . ....... .. ...... . .... D86064.1_Cry2Aa3 .... . .. ...... ........ . ..... ..... ...... . . .. ..A........ ... .. .. ... . A... . ..... .. .......C.. . .. ..A....... . ....... .. .. GA .. . .... AF047038.1_Cry2Aa4 .... . .. ...... ........ . ..... ..... ...... . . .. .. . ........ ... .. .. ... . A... . ..... .. .......... . .. .......... . ....... .. ...... . .... AJ132464.1_Cry2Aa5 .... . .. .....A........ . ..... ..... ...... . . .. .. . ........ ... .. .. ... . A... . ..... .. .......... . .. .......... . ....... .. ...... . .... AJ132465.1_Cry2Aa6 .... . .. ...... ........ . ..... ..... ...... . . .. .. . ........ ... .. .. ... . A... . ..... .. .......... . .. .......... . ....... .. ...... . .... M23724.1_Cry2Ab1 .... . .. ...... ........ . ..... ..... ...... . . .. ..A........ . A . .. .. ..G. A... . ..... .. .......C..T.. ... C ...... . ....G .. .. ...C.. . ...G X55416.1_Cry2Ab2 .... . .. ...... ........ . ..... ..... ...... . . .. ..A........ . A . .. .. ..G. A... . ..... .. .......C..T.. ... C ...... . ....G .. .. ...C.. . ...G X57252.1_Cry2Ac1 .. T . . .. ...... ......T.G.. T .. ..... ...G.. . . .. ..A.C...... ... .. ..A.. . A... . .. G.. .. ..G....C.. . .. .. G....... . ....... .. .. GC.. .T.. T
370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 CA AGCGA ATATA AG G GAGT T TA ATCA ACA AGTAGATA AT T T T T TA A AC C CTACTCA A A AC C CTGT TC CT T TATCA ATA ACT TCT TCG GT TA ATACA ATGCAGCA AT TAT T TCTA A ATAGA M31738.1_cry2Aa1 .. ..... ..... .. . .... . .. .... ... ........ .. . . .. . .. . ....... . . .. . .... .. .. . ..... ... ... ... ... .. .. ..... ........ .. ... . .... . ..... M23723.1_Cry2Aa2 .. ..... ..... .. . .... . .. .... ... ........ .. . . .. . .. . ....... . . .. . .... .. .. . ..... ... ... ... ... .. .. ..... ........ .. ... . .... . ..... D86064.1_Cry2Aa3 .. ..... ..... .. . .... . .. .... ... ........ .. . . .. . .. . ....... . . .. . .... .. .. . ..... ... ... ... ..A.. .. ..... ........ .. ... . .... . ..... AF047038.1_Cry2Aa4 .. ..... ..... .. . .... . .. .... ... ........ .. . . .. . .. . ....... . . .. . .... .. .. . ..... ... ... ... ... .. .. ..... ........ .. ... . .... . ..... AJ132464.1_Cry2Aa5 .. ..... ..... .. . .... . .. .... ... ........ .. . . .. . .. . ....... . . .. . .... .. .. . ..... ... ... ... ... .. .. ..... ........ .. ... . .... . ..... AJ132465.1_Cry2Aa6 .. ..... ..... .. . .... . .. .... ... ........ .. . . .. . .. . ....... . . .. . ...C.. .. . ..... ... ... ... ... .. .. ..... ........ .. ... . .... . ..... M23724.1_Cry2Ab1 .. ...A . ..G..GA A.... . .. ...G... ........ .. . . .G. .. . ... AC .G. . ..G.... .. .. . ..... ... ... ... ..A.. .. ..... ..... A.. .. ... . .... . ..... X55416.1_Cry2Ab2 .. ...A . ..G..GA A.... . .. ...G... ........ .. . . .G. .. . ... AC .G. . ..G.... .. .. . ..... ... ... ... ..A.. .. ..... ..... A.. .. ... . .... . ..... X57252.1_Cry2Ac1 .. ..... ..G.G GCA.... . .. ...G... ........ .. . . .. . .. . ... A... . . .. . .... .. .. . ..G.. ... .T .GA. ..A.. .. .....T ....... .. ... . .... .G....
490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 T TAC C C CAGT TC CAGATACGAG GATAC CAGT TGT TAT TAT TAC CT T TAT T TGCACAG GCAGC CA ATATGCATCT T TCT T T TAT TAGAGATGT TAT TCT TA ATGCAGATGA ATG G G GTAT T M31738.1_cry2Aa1 . ... . . .... .. .......A .. ..... .... ... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .......... . ... . . ... ......... ... ... .. .......... ... . . .... . M23723.1_Cry2Aa2 . ... . . .... .. .......A .. ..... .... ... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .......... . ... . . ... ......... ... ... .. .......... ... . . .... . D86064.1_Cry2Aa3 . ... . . .... .. .......A .. ..... .... ... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .......... . ... . . ... ......... ... ... .. .......... ... . . .C.. . AF047038.1_Cry2Aa4 . ... . . .... .. .......A .. ..... .... ... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .......... . ... . . ... ......... ... ... .. .......... ... . . .... . AJ132464.1_Cry2Aa5 . ... . . .... .. .......A .. ..... .... ... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .......... . ... . . ... ......... ... ... .. .......... ... . . .... . AJ132465.1_Cry2Aa6 . ... . . .... .. .......A .. ..... .... ... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .......... . ... . . ... ......... ... ... .. .......... ... . . .... . M23724.1_Cry2Ab1 . ... . . .... .. .....G.A .. ..... .. AC... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .. T .A..... . ... . . ... ......... ... ...A . .......... ... . . .A .. . X55416.1_Cry2Ab2 . ... . . .... .. .....G.A .. ..... .. AC... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .. T .A..... . ... . . ... ......... ... ...A . .......... ... . . .A .. . X57252.1_Cry2Ac1 . ... .A.... .. .......A .. .C..T.. AC... ... ... ... .. . ... . ....... ..... .. .. T .CA .... . ... . . ... ..... G...C..C .. .. .......... ... . . .C.. .
610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 TCAGCAGCA ACAT TACGTACGTATCGAGAT TAC CTGAGA A AT TATACA AGAGAT TAT TCTA AT TAT TGTATA A ATACGTATCA A ACTGCGT T TAGAG G GT TA A ACAC C CGT T TACACGAT M31738.1_cry2Aa1 ......... .... ................. ... ...... . .. ...... ...... ... .... .. ... ...... . .......... . ....... . ..... . .. .. . .... . ... . ........ M23723.1_Cry2Aa2 ......... .... ................. ... ...... . .. ...... ...... ... .... .. ... ...... . .......... . ....... . ..... . .. .. . .... . ... . ........ D86064.1_Cry2Aa3 ......... ...C................C... ...... . .. ...... ...... ... .... .. ... ...... . .......... . ....... . ..... . .. .. . ...T T T.. . ........ AF047038.1_Cry2Aa4 ......... .... ................. ... ...... . .. ...... ...... ... .... .. ... ...... . .......... . ....... . ..... . .. .. . .... . ... . ........ AJ132464.1_Cry2Aa5 ......... .... ................. ... ...... . .. ...... ...... ... .... .. ... ...... . .......... . ....... . ..... . .. .. . .... . ... . ........ AJ132465.1_Cry2Aa6 ......... .... ................. ... ...... . .. ...... ...... ... .... .. ... ...... . .......... . ....... . ..... . .. .. . .... . ... . ........ M23724.1_Cry2Ab1 ......... .... ................. ...T ... A . . .. ...... ...... ..C.... .C... ...... . .......... . .G..... . .. A .. .T . .. . ....T... . ........ X55416.1_Cry2Ab2 ......... .... ................. ...T ... A . . .. ...... ...... ..C.... .C... ...... . .......... . .G..... . .. A .. .T . .. . ....T... . ........ X57252.1_Cry2Ac1 ......... ...G....C..A...A.....C.. ...... . . A. T .CAC...... ..C.... .. ... ...... . ..C ....... . .....A. . ..... .T . .. . .. CA. ... . ... C ....
730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 ATGT TAGA AT T TAGA ACATATATGT T T T TA A ATGTAT T TGA ATATGTATC CAT T TG GTCAT T T T T TA A ATATCAGAGTCT TATG GTATCT TCTG GCGCTA AT T TATATGCTAGCG GTAGT M31738.1_cry2Aa1 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ... ......... ... . .. ..... .G. . .. . ............ .... ...... .... ...... .. . ............ ..... M23723.1_Cry2Aa2 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ... ......... ... . .. ..... .G. . .. . ............ .... ...... .... ...... .. . ............ ..... D86064.1_Cry2Aa3 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ... ......... ... . .. ..... .G. . .. . ............ .... ...... .... ...... .. . ..........T. ..... AF047038.1_Cry2Aa4 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ... ......... ... . .. ..... .G. . .. . ............ .... ...... .... ...... .. . ............ ..... AJ132464.1_Cry2Aa5 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ... ......... ... . .. ..... .G. . .. . ............ .... ...... .... ...... .C. ............ ..G .. AJ132465.1_Cry2Aa6 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ... ......... ... . .. ..... .G. . .. . ............ .... ...... .... ...... .. . ............ ..... M23724.1_Cry2Ab1 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ...G........T..C.. ...G. .G. . .. . ...... A ..... .C.A...... .. C. .T.... .. . .......A ..T. ..... X55416.1_Cry2Ab2 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ...G........T..C.. ...G. .G. . .. . ...... A ..... .C.A...... .. C. .T.... .. . .......A ..T. ..... X57252.1_Cry2Ac1 .... .... .. . .... .......... . . . .. . ...... . ... ......C..T..C.. ...G. .A. . .. . ...... A ..C .. .C.A...... .. C. ...... .. . .......G..T. .....
850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950 960
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 G GAC CACAGCAGACACA ATCAT T TACAGCACA A A ACTG GC CAT T T T TATAT TCTCT T T TC CA AGT TA AT TCGA AT TATATAT TATCTG GTAT TAGTG GTACTAG GCT T TCTAT TAC CT TC M31738.1_cry2Aa1 . ... ............. ..... . ......... . . .... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. .... .. ....... ...... .... ..... ....... ... . ..... ... .. .. M23723.1_Cry2Aa2 . ... ............. ..... . ......... . . .... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. .... .. ....... ...... .... ..... ....... ... . ..... ... .. .. D86064.1_Cry2Aa3 . ... ............. ..... . ...T..... . . .... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. .... .. ....... ...... .... ..... ... A... ... . ....C... .. .. AF047038.1_Cry2Aa4 . ... ............. ..... . ......... . . .... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. .... .. ....... ...... .... ..... ....... ... . ..... ... .. .. AJ132464.1_Cry2Aa5 . ... ............. ..... . ......... . . .... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. .... .. ....... ...... .... ..... ....... ... . ..... ... .. .. AJ132465.1_Cry2Aa6 . ... ............. ..... . ......... . . .... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. .... .. ....... ...... .... ..... ....... ... . ..... ... .. .. M23724.1_Cry2Ab1 . ... .......... C .. ..... . ...T T.... .G.... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. ..A . .. ...G.G. .. A A.. .AT . ..... ..G.... ... . .... A... .. .. X55416.1_Cry2Ab2 . ... .......... C .. ..... . ...T T.... .G.... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. ..A . .. ...G.G. .. A A.. .AT . ..... ..G.... ... . .... A... .. .. X57252.1_Cry2Ac1 . .T. ..- - - -..... ..... . ......... . . .... .. ... . . . ..... ..... . . .. .. ... .. .. ..T. .. ...G... .. A A.. .. T .G.... ..G.... .AC CA. C.. ...T . ..
970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 C CTA ATAT TG GTG GT T TAC CG- - - -G GTAGTACTACA ACTCAT TCAT TGA ATAGT- - -GC CAG G GT TA AT TATAGCG GAG GAGT T TCATCTG GTCTCATATG G GCGACTA ATCTCA AT M31738.1_cry2Aa1 . ... .... .. ... .. . ... ..- - - -. ........... ...... .... ... .....- - -.. ... . .. .. .. ....... ... .... . ....... ........G . . ....... ...... .. M23723.1_Cry2Aa2 . ... .... .. ... .. . ... ..- - - -. ........... ...... .... ... .....- - -.. ... . .. .. .. ....... ... .... . ....... ........G . . ....... ...... .. D86064.1_Cry2Aa3 . ... .... .. ... .. . ... ..- - - -. ........... .T .... .... ... .C...- - -.. ... . .. .. .. ....... ... .... . ....... ........G . . ....... ...... .. AF047038.1_Cry2Aa4 . ... .... .. ... .. . ... ..- - - -. ........... ...... .... ... .....- - -.. ... . .. .. .. ....... ... .... . ....... ........G . . ....... ...... .. AJ132464.1_Cry2Aa5 . ... .... .. ... .. . ... ..- - - -. ........... ...... .... ... .....- - -.. ... . .. .. .. ....... ... .... . ....... ........G . . ....... ...... .. AJ132465.1_Cry2Aa6 . ... .... .. ... .. . ... ..- - - -. ........... ...... .... ... .....- - -.. ... . .. .. .. ....... ... .... . ....... ........G . . ....... ...... .. M23724.1_Cry2Ab1 . ... ....A.T .. .. . ... .T- - - -. .. TC....... .....CG... ..CT .GC.- - -..A .. . .. .. .. ..C..T. ... .. A. . ..G.... ..GAT...G .T..AT..C CGT . T. .. X55416.1_Cry2Ab2 . ... ....A.T .. .. . ... .T- - - -. .. TC....... .....CG... ..CT .GC.- - -..A .. . .. .. .. ..C..T. ... .. A. . ..G.... ..GAT...G .T..AT..C CGT . T. .. X57252.1_Cry2Ac1 . ... .... .. ... ..C. T. . CGTCTAC CAC. ACT.A ...T TG...- - - -T T T..G.. .A. .. .. .....A. .T. ....G......A.C .G....G .TCA AG... .... T. ..
1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 CACA ACT T TA AT TGCAGCACG GTC CTC C CTC CT T TATCA ACAC CAT T TGT TAGA AGT TG GCTG GAT TCAG GTACAGATCGAGAG G GCGT TGCTAC CTCTACGA AT TG GCAGACAGA ATC C M31738.1_cry2Aa1 .... ... . .. .. ......... ... ... . ... .. . ..... .... ... . ... .... ... .. .... ... .... .............. . .... ...... ........ .. .. ......... ... . M23723.1_Cry2Aa2 .... ... . .. .. ......... ... ... . ... .. . ..... .... ... . ... .... ... .. .... ... .... .............. . .... ...... ........ .. .. ......... ... . D86064.1_Cry2Aa3 .... ... . .. .. ......... ... ... . ... .. . ..... .... ... . ... .... ... .. .... ... .... .............. . .... ...... ........C. .. ......... ... . AF047038.1_Cry2Aa4 .... ... . .. .. ......... ... ... . ... .. . ..... .... ... . ... .... ... .. .... ... .... .............. . .... ...... ........ .. .. ......... ... . AJ132464.1_Cry2Aa5 .... ... . .. .. ......... ... ... . ... .. . ..... .... ... . ... .... ... .. .... ... .... .............. . .... ...... ........ .. .. ......... ... . AJ132465.1_Cry2Aa6 .... ... . .. .. ......... ... ... . ... .. . ..... .... ... . ... .... ... .. .... ... .... .............. . .... ...... ........ .. .. ......... ... . M23724.1_Cry2Ab1 .. A . .T . . .. .. ..T.....AT . T... . . C . .A. .G. T. ..G. ... . ... ... G... .. ...A... .... .. T....... G ... . .... ... C.. .GT ...A . .. .. ... A ..... ... . X55416.1_Cry2Ab2 .. A . .T . . .. .. ..T.....AT . T... . . C . .A. .G. T. ..G. ... . ... ... G... .. ...A... .... .. T....... G ... . .... ... C.. .GT ...A . .. .. ... A ..... ... . X57252.1_Cry2Ac1 .. A . ... . .. .CAT T TC ...AC. T T ..A A.. .. . ..CA . .... .G. . .A. .... ... .. ...A... ..T. .......... G .. A. .... ... C.. ......A . .C.. ... AT... G.G. .
81 Hình 3.11. So sánh trình tự gen của chủng MSS8.4 với với các gen cry
từ Ngân hàng Gen Quốc tế.
Các vị trí nucleotide đƣợc khoanh màu là vị trí bị đột biến.
So sánh trình tự amino axit (aa) suy diễn của 2 gen trên bằng công cụ so sánh BLAST trên NCBI cho thấy,trình tự axit amin của chủng LNT7.12 có độ tương đồng hoàn toàn với chủng công bố, chủng MSS8.4 có độ tương đồng 99% với các trình tự axit amin của Cry2A từ B. thuringiensis với 5 vị trí sai khác (102 (S-N), 167 (R-Q), 261 (F-L), 352 (W-G), 435 (D-N)), đột biến nu ở vị trí 1575 (C-T) không làm thay thế axit amin (chi tiết tại Hình 3.12). Điều này chứng tỏ rằng 2 gen
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 T T TCA A ACA ACT T TA AGT T TA AG GTGTG GTGCT- - - -T T T TCAGC C CGTG GA A AT TCA A ACTAT T TC C CAGAT TAT T T TATC CGTA ATAT T TCTG G G GT TC CT T TAGT TAT TAGAGAC M31738.1_cry2Aa1 . . ... . ... ... . .. ... . .. .. ..... .....- - - -. . . ..... . .... .. . .. ... . ..... . .. . ..... ... . . .... .... .... . .... . . .. .. .. . .... ... .... A .. M23723.1_Cry2Aa2 . . ... . ... ... . .. ... . .. .. ..... .....- - - -. . . ..... . .... .. . .. ... . ..... . .. . ..... ... . . .... .... .... . .... . . .. .. .. . .... ... .... A .. D86064.1_Cry2Aa3 . .C .. . .T. ... .C.G .. . .. .. ..... ..... T T TC CT . . . .....T.... .. . .. ... . ..... . .. . ..... ... . . .... .... .... . .... . . .. .. .. . .... ... .... A .. AF047038.1_Cry2Aa4 . . ... . ... ... . .. ... . .. .. ..... .....- - - -.C. ..... . .... .. . .. ... . ..... . .. . ..... ... . . .... .... .... . .... . . .. .. .. . .... ... .... A .. AJ132464.1_Cry2Aa5 . . ... . ... ... . .. ... . .. .. ..... .....- - - -. . . ..... . .... .. . .. ... . ..... . .. . ..... ... . . .... .... .... . .... . . .. .. .. . .... ... .... A .. AJ132465.1_Cry2Aa6 . . ... . ... ... . .. ... . .. .. ..... .....- - - -. . . ..... . .... .. . .. ... . ..... . .. . ..... ... . . .... .... .... . .... . . .. .. .. . .... ... .... A .. M23724.1_Cry2Ab1 . . .G.G... ... . ..G . G. .. .. .A... .....- - - -. . .A....T..C. .T. .. ... . ..... . .. . ..... ... . . ... T.... .... . .... .A.. .. .. . .... .G. .... A .T X55416.1_Cry2Ab2 . . .G.G... ... . ..G . G. .. .. .A... .....- - - -. . .A....T..C. .T. .. ... . ..... . .. . ..... ... . . ... T.... .... . .... .A.. .. .. . .... .G. .... A .T X57252.1_Cry2Ac1 . . .G.G... ... . ..- - -. ..C.A. T .A.CAT .- - - -. . . .....T.... .T. .. ..G. ... T . . .. . ..... ... . . .... .... .... . .... .T.. .GT .G G GAC... ...CA ..
1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 GA AGATCTA ACA AGAC CGT TACACTATA AC CA A ATA AGA A ATATAGA A AGTC CT TCG G GA ACAC CTG GTG GAGCACG G GC CTAT T TG GTATCTGTGCATA ACAGA A A A A ATA ATATCTAT M31738.1_cry2Aa1 .. ....... ... .... ... ......... .. .. . ... ... . ....... . .... .. ... . .. .... ... ... ....... . .. .... . .. ............. ..... . . ... ........ M23723.1_Cry2Aa2 .. ....... ... .... ... ......... .. .. . ... ... . ....... . .... .. ... . .. .... ... ... ....... . .. .... . .. ............. ..... . . ... ........ D86064.1_Cry2Aa3 .. ....... ... .... ... ......... .. .. . ... ... . ....... . .... .. ... . .. .... ... ... ..T T...A..T ...A.. ............. ..... . . ... ........ AF047038.1_Cry2Aa4 .. ....... ... .... ... ......... .. .. . ... ... . ....... . .... .. ... . .. .... ... ... ....... . .. .... . .. ............. ..... . . ... ........ AJ132464.1_Cry2Aa5 .. ....... ... .... ... ......... .. .. . ... ... . ....... . .... .. ... . .. .... ... ... ....... . .. .... . .. ............. ..... . . ... ........ AJ132465.1_Cry2Aa6 .. ....... ... .... ... ......... .. .. . ... ... . ....... . .... .. ... . .. .... ... ... ....... . .. .... . .. ............. ..... . . .G... ........ M23724.1_Cry2Ab1 .. .... T .. .G. .... ... ......... .TG. . ... ... . ......C. .... .. ..A. .. .... ... ... .......A..T ...A.. ............. ..... . . ... ..... C.. X55416.1_Cry2Ab2 .. .... T .. .G. .... ... ......... .TG. . ... ... . ......C. .... .. ..A. .. .... ... ... .......A..T ...A.. ............. ..... . . ... ..... C.. X57252.1_Cry2Ac1 .C.... T ..G.. .... .TC...... T .. .TG. . ... ...G...... G.- - - -ACGAC....GTC..TAGC C. T... A.A....... ..... . . ... ........
1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 1550 1560
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 GC CGCTA ATGA A A ATG GTACTATGATC CAT T TG GCGC CAGA AGAT TATACAG GAT T TACTATATCGC CA ATACATGC CACTCA AGTGA ATA ATCA A ACTCGA ACAT T TAT T TCTGA A A A A M31738.1_cry2Aa1 .. ..... .... . . ... ........... ... . .. .... .... .... ....... ... . ........... .. ........ ...... ..... ... .... . ...... .... . ... . ..... . . . . M23723.1_Cry2Aa2 .. ..... .... . . ... ........... ... . .. .... .... .... ....... ... . ........... .. ........ ...... ..... ... .... . ...... .... . ... . ..... . . . . D86064.1_Cry2Aa3 .. ....C.... . . ... .......... T... . .. ..A. .G .. .... ....... ... . .........A. .. ........ ...... ..... ... .... . ...... .... . ... . ..... . . . . AF047038.1_Cry2Aa4 .. ..... .... . . ... ........... ... . .. .... .... .... ....... ... . ........... .. ........ ...... ..... .C. .... . ...... .... . ... . ..... . . . . AJ132464.1_Cry2Aa5 .. ..... .... . . ... ........... ... . .. .... .... .... ....... ... . ........... .. ........ ...... ..... ... .... . ...... .... . ... . ..... . . . . AJ132465.1_Cry2Aa6 .. ..... .... . . ... ........... ... . .. .... .... .... ....... ... . ........... .. ........ ...... ..... ... .... . ...... .... . ... . ..... . . . . M23724.1_Cry2Ab1 ..T.T .C.... . . ... .. T....... T... . .A.... .. A .T..C....... ... . ...... T .... .G........A ..... ..... ... .... . ..A... .... . ... . ..... . . . . X55416.1_Cry2Ab2 ..T.T .C.... . . ... .. T....... T... . .A.... .. A .T..C....... ... . ...... T .... .G........A ..... ..... ... .... . ..A... .... . ... . ..... . . . . X57252.1_Cry2Ac1 .A.A..C.... . . ... .......... T... . .A.... .. A .T..C....... ... . ... CG....T. .. ........ ...... ...A . ... .... . .T .... ..G. . ... . .. C.. . . . .
1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 T T TG GA A ATCA AG GTGAT TC CT TA AGAT TCGA ACA A AGCA ACACGACAGCTCGT TATACGCT TAGAG G GA ATG GA A ATAGT TACA ATCT T TAT T TA AGAGTATCT TCA ATAG GA A AT TCA M31738.1_cry2Aa1 . . .. .. . .... .. ..... .. .. .. .... . T.. ... . .... .............. ........ ..... . .. ... .. . ..... .... .... . ... . .. ......... ... .... .. . .. ... M23723.1_Cry2Aa2 . . .. .. . .... .. ..... .. .. .. .... . T.. ... . .... .............. ........ ..... . .. ... .. . ..... .... .... . ... . .. ......... ... .... .. . .. ... D86064.1_Cry2Aa3 . . .. .. . .... .. ..... .. .. .. .... . T.. ... . ..T. .............. ........ ..... . .. ... .. . ..... .... .... . ... . .. ......... ... .... .. . .. ... AF047038.1_Cry2Aa4 . . .. .. . .... .. ..... .. .. .. .... . T.. ... . .... .............. ........ ..... . .. ... .. .G.... .... .... . ... . .. ......... ... .... .. . .. ... AJ132464.1_Cry2Aa5 . . .. .. . .... .. ..... .. .. .. .... . T.. ... . .... ..............C....... ..... . .. ... .. . ..... .... .... . ... . .. ......... ... .... .. . .. ... AJ132465.1_Cry2Aa6 . . .. .. . .... .. ..... .. .. .. .... . T.. ... . .... .............. ........ ..... . .. ... .. . ..... .... .... . ... . .. ......... ... .... .. . .. ... M23724.1_Cry2Ab1 . . .. .. . .... .. ..... ..T . .. .. G. . T.. ... . . A.. .............. ........ ..... . .. ... .. . ..... .... .... . ... . .. ..... T ... ... .... .. . .. .. C X55416.1_Cry2Ab2 . . .. .. . .... .. ..... ..T . .. .. G. . T.. ... . . A.. .............. ........ ..... . .. ... .. . ..... .... .... . ... . .. ..... T ... ... .... .. . .. .. C X57252.1_Cry2Ac1 .A.. .T. ....G . ..... .. .. .G.... . T..G.T. .... .. C .A ..G .....A..C..A.. ..... . .. ... .. . ..... .... .... . ... . .. ......... ... .... .. .G. .. C
1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 ACTAT TCGAGT TACTATA A ACG GTAGAGT T TATACTGT T TCA A ATGT TA ATAC CACTACA A ATA ACGATG GAGT TA ATGATA ATG GAGCTCGT T T T TCAGATAT TA ATATCG GTA ATATA M31738.1_cry2Aa1 ..... ...... ....... . ... ....... . ........ . ... . .... .. .... ....... . ... ...... .... .. ...... ... ........ . . . ........ .. ...... ... ..... M23723.1_Cry2Aa2 ..... ...... ....... . ... ....... . ........ . ... . .... .. .... ....... . ... ...... .... .. ...... ... ........ . . . ........ .. ...... ... ..... D86064.1_Cry2Aa3 .....C ..... ....... . ... .... G .. . .......C. ... . .... .. ....T. A.... . ... ...... . G .. .. ...... ... ........ . . . ........ .. ...... ... ..G.. AF047038.1_Cry2Aa4 ..... ...... ....... . ... ....... . ........ . ... . .... .. .... ....... . ... ...... .... .. ...... ... ........ . . .C ....... .. ...... ... ..... AJ132464.1_Cry2Aa5 ..... ...... ....... . ... ....... . ........ . ... . .... .. .... ....... . ... ...... .... .. ...... ... ........ . . . ........ .. ...... ... ..... AJ132465.1_Cry2Aa6 ..... ...... ....... . ... ....... . ........ . ... . .... .. .... ....... . ... ...... .... .. ...... ... ........ . . . ........ .. ...... ... ..... M23724.1_Cry2Ab1 ..... ...... ....... . ... .... G ..A.......C.A.. . .... .. ....T...... . ... ...... .... .. ...... ... ........ . . . ........ .. ...... ... ..G.. X55416.1_Cry2Ab2 ..... ...... ....... . ... .... G ..A.......C.A.. . .... .. ....T...... . ... ...... .... .. ...... ... ........ . . . ........ .. ...... ... ..G.. X57252.1_Cry2Ac1 ..A .. ...... ....... . ... ....... . ......- - -G.. . .... .. ....T.. C... . ... .T.... ....ACT ..... ... ........ . . . ........ .. ...... ... ..G..
1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 1910
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . MSS8.4 GTAGCA AGTGATA ATACTA ATGTA ACGCTAGATATA A ATGTGACAT TA A ACTC CG GTACTC CAT T TGATCTCATGA ATAT TATGT T TGTGC CA ACTA ATCT TC CAC CACT T TAT M31738.1_cry2Aa1 ...... ....... ...... ..... ............ . ......... .. . .... .. ...... ... . ........... .... ..... . ..... .. .... .... .. ... .... . ... M23723.1_Cry2Aa2 ...... ....... ...... ..... ............ . ......... .. . .... .. ...... ... . ........... .... ..... . ..... .. .... .... .. ... .... . ... D86064.1_Cry2Aa3 ...... ....... ...... .....C ..T ........ . ......... .. . .... .. ......A .. . ...G.. T.... .... ..... . ..... .. .... .... .. ... .... . ... AF047038.1_Cry2Aa4 ...... ....... ...... ..... ............ . ......... .. . .... .. ...... ... . ........... .... ..... . ..... .. .... .... .. ... .... . ... AJ132464.1_Cry2Aa5 ...... ....... ...... ..... ............ . ......... .. . .... .. ...... ... . ........... .... ..... .C.... .. .... .... .. ... .... . ... AJ132465.1_Cry2Aa6 ...... ....... ...... ..... ............ . ......... .. . .... .. ...... ... . ........... .... ..... . ..... .. .... ... C.. ... .... . ... M23724.1_Cry2Ab1 ...... ...AG.. .. T..G.....C .AT ........ . ....A .... .. . .... .. ......A .. . ...... T.... .... ....C. ...A. .. .... ..A. . T... .... . ... X55416.1_Cry2Ab2 ...... ...AG.. .. T..G.....C .AT ........ . ....A .... .. . .... .. ......A .. . ...... T.... .... ....C. ...A. .. .... ..A. . T... .... . ... X57252.1_Cry2Ac1 ..G ... ....C.. ...... .....C .AT ........C. A....... . T. ..G G.A A.C .A.A .. . ...G.. T.... .... ..... . ... T. .. .... .... .. ... .... . ...