Phương pháp sinh học phân tử

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử

2.3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn

Tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Maniatis: Các chủng B.thuringiensis được lên men lắc ở môi trường LB ở 370 C qua đêm. Ly tâm ở 6.000 vũng/phỳt, thu cặn tế bào. Bổ sung 567 àl TE (10:1), 30 àl SDS 10%, 3 àl proteinase K, ủ ở 370 C trong 1h. Bổ sung 180 àl NaCl 5M, ủ ở 650C trong 10 phỳt.

Bổ sung 800 àl chloroform, ly tõm ở 10.000 vũng/10 phỳt, thu 600 àl dịch nổi, bổ sung 300 àl chloroform và 300 àl phenol, trộn đều rồi ly tõm 10.000 vũng/10 phỳt thu 600 àl dịch nổi. Bổ sung thờm 600 àl chloroform để loại phenol, ly tõm 10.000 vũn/10 phỳt thu 400 àl dịch nổi. Bổ sung 40 àl NaOAC và 1ml cồn tuyệt đối, ủ ở - 200 C sau 4h, ly tâm 14.000 vòng/20 phút, thu căn ADN. Rửa lại với 1 ml cồn 700C.

Sấy khụ cặn trong tủ vụ trựng, loại Rnase bằng cỏch bổ sung 20 àl TE-Rnase và ủ ở 370C trong 1h.

Nồng độ ADN được xác định bằng phương pháp đo độ hấp phụ ở bước sóng 260nm(A260) và đƣợc tính bằng công thức

A260 x 50 x hệ số pha loóng = àg ADN/ml

Sau khi xác định nồng độ, ADN đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

2.3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn

DNA plasmid của vi khuẩn đƣợc tách chiết và tinh sạchbằng kit GenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Một khuẩn lạc dương tính được nuôi lắc trong 5 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào đƣợc thu bằng ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, sau đó đƣợc hũa tan trong 250 àl đệm P1 đó bổ sung enzyme Rnase A. Bổ sung 250àl đệm P2, đảo nhẹ 3-5 lần và ủ ở nhiệt độ phũng 5 phỳt. Bổ sung 350àl đệm trung hũa P3 và

54 ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C để loại bỏ mảnh vỡ tế bào và protein biến tính. Dịch nổi đƣợc đƣa lên cột và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phỳt. Plasmid trờn lớp màng silica đƣợc rửa hai lần bởi 500àl đệm rửa. Bổ sung 50 àl đệm đẩy và chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới để thu DNA plasmid bằng ly tâm với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Mẫu DNA plasmid tinh sạch bảo quản ở -20°C.

2.3.3.3. Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A

Sinh tổng hợp DNA đƣợc tiến hành bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) (Sambrook, 2001). Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trên máy chu kỳ nhiệt, sử dụng cặp mồi đặc hiệu có trình tự đã đƣợc nêu ở phần vật liệu. Thành phần cho 15 àl phản ứng: 9,8 àl dd H2O; 1,5 àl đệm Taq DNA polymerase; 0,5 àlTaq DNA polymerase (5 u/àl);1,5 àl dNTPs 2mM; 0,6 àl mồi xuụi (10 pmol/àl ); 0,6 l mồi ngƣợc (10 pmol/àl); 0,5 àl DNA khuụn. Phản ứng đƣợc thực hiện với chu kỳ nhiệt:

biến tính ban đầu ở 94oC trong 3 phút; 30 chu kỳ: biến tính ở 94oC – 1 phút, gắn mồi ở 56oC – 1 phút 30 giây và kéo dài chuỗi ở 72oC - 2 phút; giai đoạn hoàn thành kéo dài chuỗi ở 72oC – 10 phút. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và bảo quản ở -20oC.

2.3.3.4. Phương pháp tách dòng gen cry2 Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn

Enzyme cắt giới hạn là enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu, phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bazơ nucleotide. Trình tự nhận biết của enzyme giới hạn đƣợc cấu tạo từ 4 đến 6 đôi bazơ và có cấu trúc đối xứng nghịch đảo. Enzyme cắt giới hạn có thể cắt ngay chính giữa trình tự nhận biết để tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng hoặc có thể cắt lệch tâm để tạo ra hai đoạn DNA có kiểu đầu dính. Các đoạn DNA bị enzyme giới hạn cắt có thể đƣợc nối trở lại bằng enzyme ligase nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau. Các thí nghiệm nhân dòng gen cry2A, thiết kế vector nhân dòng, vector biểu hiện sử dụng các loại enzym giới hạn khác nhau tùy theo

55 mục đích thí nghiệm. Quy trình sử dụng các enzym giới hạn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ghép nối DNA bằng T4 DNA ligase

Tất cả các thí nghiệm ghép nối DNA trong nhân dòng gen cry2A, vector biểu hiện sử dụng T4 DNA ligase theo hướng dẫn của hãng Invitrogen. Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4 - DNA ligase. Tùy vào nồng độ và chiều dài của đoạn gen cần nối mà có tỉ lệ trộn mẫu plasmid và đoạn gen nối (Sản phẩm PCR) khác nhau. Quá trình nối ghép đƣợc thực hiện trong điều kiện 4 - 6oC để tạo vector tái tổ hợp.

Thành phần phản ứng:

2X ligation buffer: 5 àl Vector : 1 àl T4 - DNA ligase: 1 àl Sản phẩm PCR: 3 àl

Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α

Chuẩn bị tế bào khả biến DH5α theo phương pháp của Hanahan, 1997. Ta chọn một khuẩn lạc dương tính của tế bào được nuôi lắc trong 5 ml LB lỏng với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Lấy 1 ml dịch nuôi qua đêm hòa loãng trong 100 ml LB lỏng và nuôi lắc ở 37°C đến khi OD đạt 0,4 – 0,5. Tế bào đƣợc thu bằng ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, sau đó đƣợc hòa tan trong 40 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh. Tiếp tục ly tâm để thu tế bào và hòa tan tế bào khả biến DH5α trong 4 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh chứa 15% glycerol. Dung dịch chứa tế bào khả biến DH5α đƣợc chia nhỏ 80àl cho ống eppendorf 1,5 ml và bảo quản ở -80 oC.

Sản phẩm phản ứng ghép nối DNA, gen cry2A đƣợc gắn vào vectơ pCR2.1 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến DH5α. Tế bào khả biến DH5α đƣợc làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, hỗn hợp phản ứng ghép nối đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây,

56 sau đú đƣợc chuyển lại ủ trờn đỏ trong 2 phỳt. Tiếp theo, bổ sung 450 àl LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 20 phút trước khi được nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào đƣợc cấy trải trờn đĩa mụi trường LB đặc cú bổ sung chất khỏng sinh ampicilin 100 àg/ml và ủ ở 37°C qua đêm.

2.3.3.5. Phương pháp điện di trên gel agarose

DNA được phát hiện và định lượng tương đối bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose theo phương pháp của Sambrook & Russel, 2001. Đun nóng chảy 1,0 g agarose trong 100 ml đệm TAE và đúc vào khuôn. Sau khi gel đông hoàn toàn, mẫu DNA đƣợc trộn với đệm mẫu (6X) có chứa chất chỉ thị màu (bromophenol xanh, xylene cyanol), glycerol 20% và EtBr ở nồng độ 50 g/àl theo tỉ lệ thể tớch 6:1 và đƣợc tra vào các giếng trên bản gel. Mẫu DNA trên gel đƣợc điện di với hiệu điện thế ổn định 10 V/cm gel đến khi vạch màu chỉ thị cách mép gel 2 cm thì dừng lại.

Sau đó, gel được lấy ra và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel (Firereader-UVITEC), các đoạn DNA gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên nền gel.

2.3.3.6. Tinh sạch DNA từ gel agarose

Sản phẩm DNA đƣợc tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kít GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất. Các băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác từ gel agarose và đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung đệm bỏm với tỉ lệ 1 àl đệm cho 1 mg gel và ủ ở 60°C trong 10 phỳt đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đƣợc chuyển lên cột và ly tâm với tốc độ 10.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt. Rửa cột hai lần bằng bổ sung 500 àl đệm rửa và ly tõm 1 phỳt với vận tốc 10.000 vũng/phỳt. Bổ sung 50 àl đệm đẩy vào chớnh giữa lớp màng silica của cột và thu DNA bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút. Mẫu DNA tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đƣợc bảo quản ở -20°C.

57 2.3.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng

Trình tự DNA được xác định theo phương pháp của Sanger và cộng sự. Mẫu DNA đƣợc gửi đọc trình tự tại hãng Microgen, Hàn Quốc. Cặp mồi M13 xuôi và ngƣợc đƣợc sử dụng để xác định trình tự hai chiều của đoạn gen đƣợc gắn vào vector tách dòng pGEM®-Teasy.

Xử lý kết quả đọc trình tự bằng phần mềm Bioedit, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế tại địa chỉ online: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

2.3.3.8.Thiết kế vector biểu hiện

Trong nghiên cứu này vector biểu hiện đƣợc lựa chọn là pET22 b(+). Theo thiết kế khi gen cry2Ađƣợc đƣa vào vector pET 22b(+) tại vị trí BamHI và XhoI sẽ tạo ra một khung đọc mở từ vị trí mở đầu tới vị trí kết thúc của vector. Trình tự amino acid của protein tái tổ hợp gồm toàn bộ trình tự amino acid của gen cry2A tự nhiên thêm 6amino acid Histidine ở đầu C và 36 amino acid đầu N. Protein tái tổ hợp được gắn thêm đuôi His-tag giúp dễ dàng tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực với Niken.Không những thế vectorpET22b (+) có chứa promoter T7 nên khả năng biểu hiện protein rất mạnh. Để gắn gen cry2A vào vector biểu hiện pET22b(+), cả vector tái tổ và pET22b(+) đƣợc cắt bằng enzymeBamHI và XhoI tạo ra gen cry2A và pET22b(+) có đầu dính tương ứng. Sau đó gen cry2A được nối với vector pET22b(+) đã đƣợc mở vòng tạo plasmid tái tổ hợp pET22b(+)-cry2A.

2.3.3.9. Phương pháp biểu hiện gen

Cấy hoạt hoá 1 khuẩn lạc trong môi trường LB có bổ sung ampicilin (100 mg/ ml) với nồng độ cuối là 50 g/ ml, nuôi lắc ở 370C qua đêm. Sau đó cấy chuyển 1% vào 20 ml môi trường MPB có bổ sung kháng sinh ampicilin nồng độ là 50 g/

ml và nuôi lắc ở 370C để OD đạt 0,5-0,8 (Khoảng 2-3h). Hút 10 ml làm đối chứng trước cảm ứng và tiếp tục nuôi lắc ở 370C trong 4h để thu mẫu không cảm ứng.

Phần còn lại, cảm ứng IPTG (100 mM) đạt 1mM, nuôi ở 370C trong 4h. Thu mẫu

58 sau cảm ứng, ly tâm thu tế bào 6000 v/p trong 10 phút. Rửa tế bào bằng nước khử ion 200 l, ly tâm 6000 v/p trong 5 phút, thu tế bào. Bổ sung 200 l nước khử ion, làm tan tế bào. Lấy 30 l dịch trên bổ sung thêm 5 l treatment buffer 6X. Xử lý mẫu ở 950C trong 10 phút. Điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.Nhuộm bản gel bằng Comassie Brilliant trong 30 phút trên máy lắc.Tẩy màu và quan sát trực tiếp.

2.3.3.10. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %

Điện di trên gel polyacrylamide thường được sử dụng để tách riêng các băng protein có trọng lượng phân tử khác nhau, đôi khi phương pháp này còn được dùng để tách các đoạn DNA có kích thước nhỏ (dưới 200 bp). Trong phương pháp này, gel được đổ giữa hai bản thủy tinh mỏng theo phương thẳng đứng.Công thức đổ gel polyacrylamide 12,6 %.

 Gel tách:

dH2O 1,968 ml

Tris HCl (3M; pH 8,8) 1 ml

Acrylamide – bis 30% 3,36 ml

Glycerol 50 % 1,6 ml

SDS 10 % 40 l

APS 10 % 40 l

Temed 6,4 l

 Gel cô:

dH2O 0,85 ml

Tris HCl (3M; pH 8,8) 165,25 l

Acrylamide – bis 30% 212,5 l

SDS 10 % 6,25 l

APS 10 % 12,5 l

Temed 1 l

59 Mẫu sau khi đƣợc xử lý với SDS buffer và biến tính (95 oC trong 10 phút) được tra vào các giếng nhỏ trong gel.Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 300 V hoặc cường độ dòng điện là 40 mA.Sau khi điện di xong, bản gel đƣợc gỡ ra và nhuộm trong dung dịch Coomassie Brilliant Blue 0,25 %, lắc khoảng 1 giờ trên máy lắc. Sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng dung dịch tẩy màu, lắc trên máy lắc khoảng 30 phút thì đổ dịch nhuộm đi cho nước vào và có thể quan sát trực tiếp.

2.3.3.11. Phương pháp Western blot

Mẫu protein sau khi kiểm tra bằng SDS-PAGE trên gel acryamide 12% sẽ đƣợc chuyển lên màng PVDF nhờ hệ thống chuyển màng Trans blot semi dry (Bio- Rad). Màng chứa kháng nguyên đƣợc phủ bằng dung dịch khóa màng (Blocking) (5% sữa tách bơ trong dung dịch đệm TBST (0,1% Tween 20 trong đệm Tris- saline)) trong 1 giờ. Sau khi rửa màng 3 lần bằng đệm TBST, màng đƣợc ủ với kháng thể 1 (kháng thể kháng His - HyTest), độ pha loãng 5000 lần. Sau 1 giờ, màng đƣợc rửa lại bằng TBST 3 lần để loại bỏ hoàn toàn liên kết không đặc hiệu.

Tiếp tục ủ màng với kháng thể 2 (kháng thể cộng hợp enzyme peroxidase kháng chuột - HyTest), độ pha loãng 10000 lần. Sau 2 giờ, màng đƣợc rửa lại 3 lần với đệm TBST và phát hiện bằng dung dịch chứa cơ chất cho peroxidase (Sigma).

Màng trong dung dịch cơ chất đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng 5 - 10 phút, sau đó đƣợc dừng phản ứng bằng H2O. Kết quả được xác định trên ánh sáng thường.

2.3.3.12.Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp

Protein tái tổ hợp đƣợc tinh sạch bằng cột sắc ký Ni2+ agarose theo quy trình hướng dẫn của hãng Invitrogen. Hòa tan trở lại tế bào mang protein tái tổ hợp trong 4 ml đệm hòa tan (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; Triton X-100 0,1%; PMSF 1 mM; β-mercaptoethanol 1 mM; benzamidine 1 mM). Tế bào đƣợc phá vỡ bằng sóng siêu âm và dịch siêu âm đƣợc ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 20 phút để loại bỏ xác tế bào. Bổ sung 1,5 ml gel Ni2+ agarose vào dịch tế bào và lắc ở 4oC

60 trong 30 phút để các protein/peptide tái tổ hợp bám vào gel agarose. Hỗn hợp gồm gel agarose và protein đƣợc nhồi vào cột và tiến hành rửa cột gel với 20 ml đệm rửa (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM, 30 mM Imidazol). Các protein không chứa nhóm His-tag sẽ chảy qua cột trong quá trình nhồi và rửa cột. Các protein/peptide chứa nhóm His-tag gắn trên cột đƣợc thu lại bằng 5 ml đệm chiết (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM, 250 mM Imidazol). Các protein/polypeptide tái tổ hợp tinh sạch đƣợc kiểm tra trên gel SDS-PAGE và bảo quản ở -80 oC.