3.4. Nghiên cứu tạo chế phẩm
3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng,hình thành bào tử và
3.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh trưởng, sinh tổng hợp deltaendotoxin của chủng MSS8.4
Vi khuẩn B. thuringiensis cũng giống nhƣ tất cả các vi sinh vật khác, do có cấu trúc bé nhỏ và đơn giản nên chịu tác động trực tiếp của các yếu tố ngoại cảnh, trong đó, pH là một trong những tác nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và hình thành các sản phẩm lên men của vi sinh vật. Phần lớn các vi sinh vật phát triển mạnh ở pH trung tính, tuy nhiên, cũng có một vài nhóm vi sinh vật ƣa axit (vi khuẩn Lactic) hoặc ƣu kiềm (nấm men candida). Vì vậy, tùy theo nhu cầu sản phẩm lên men cần có những điều chỉnh hợp lý. Để xác định pH thích hợp cho sinh trưởng của Bt, các thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: dịch thủy phân bã bia có pH 2, đƣợc điều chỉnh về các độ pH: 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0. Tiến hành các thí nghiệm trong bình nón 500 ml với dung tích môi trường 100 ml, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở bảng 3.13.
Bảng 3.13.Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng và sinh tổng hợp delta endotoxin của vi khuẩn MSS8.4
Độ pH môi trường
Mật độ TCC (CFU/ml)
Mật độ SC (CFU/ml)
Delta-endotoxin (mg/l)
5,02 3,1 x106 1,0 x106 129±10
6,01 1,1 x108 8,0 x107 489±11
6,52 2,5x108 1,9x108 522±09
7,03 2,6 x108 2,3 x109 521±12
7,51 3,5x108 3,1x108 523±09
8,02 1,1 x108 9,8 x107 331±11
9,01 5,5 x106 2,0 x106 125±12
115 - Về mặt sinh trưởng: kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.13 cho thấy MSS8.4sinh trưởng tốt trên môi trường trung tính. Ở thí nghiệm có pH ban đầu thấp (pH5) và pH cao (pH9) khả năng sinh trưởng của MSS8.4 không tốt, mật độ tế bào chỉ đạt 106 CFU/ml, tương đương với mật độ cấp giống ban đầu, thấp hơn hàng trăm lần so với mật độ tế bào đạt đƣợc ở các thí nghiệm có pH trung tính. Ở các thí nghiệm có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 mật độ tế bào đạt được trong dịch canh trường sau 48 giờ lên men tương đương nhau, sự khác nhau về số liệu trên Bảng 3.13 ở thí nghiệm có pH 6,52; 7,03 và 7,51 là không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nhƣ vậy, vi khuẩn B.
thuringiensissinh trưởng tốt trong môi trường có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 (TCC, SC đều đạt trên 108CFU/ml sau 48 giờ lên men).
- Về khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể: protein tinh thể đƣợc hình thành cùng với quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn MSS8.4, do đó, các thí nghiệm có mật độ bào tử cao cũng là các thí nghiệm có nồng độ delta endotoxin cao. Ở thí nghiệm có pH ban đầu là 6,5 – 7,5 nồng độ delta endotoxin tương đương nhau và đạt trên 520 mg/l sau 48 giờ lên men. Trong khi đó, các thí nghiệm có pH môi trường ban đầu cao (pH9) và thấp (pH5) nồng độ delta endotoxin chỉ đạt trên 100 mg/l bằng 20% giá trị đạt đƣợc ở các thí nghiệm có pH trung tính.
Quá trình lên men của vi sinh vật sẽ sản sinh ra một số sản phẩm phụ làm thay đổi pH của môi trường, tiến hành kiểm tra pH của dịch canh trường sau 48 giờ lên men cho thấy sau quá trình lên men pH của môi trường có tăng nhẹ, các thông số đƣợc thể hiện ở Bảng 3.14.
Bảng 3.14. Giá trị pH ban đầu và sau 48 giờ lên men
Thông số TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7
pH ban đầu 5,02 6,01 6,52 7,03 7,51 8.02 9,01
pH sau 72
giờ lên men 4,90 7,54 8,49 8,50 8,49 8,30 9,10
116 Theo số liệu phân tích ở Bảng 3.14 cho thấy: sau 48 lên men pH của môi trường lên men đều thay đổi. Thí nghiệm 1 và thí nghiệm 7 là hai thí nghiệm có giá trị pH không thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn B. thuringiensis, sau 48 giờ lên men, pH của dịch lên men biến đổi không đáng kể. Các thí nghiệm 2, 3, 4,5 có pH phù hợp với điều kiện sinh trưởng của B. thuringiensis, cùng với quá trình sinh trưởng B. thuringiensis đã tạo ra các sản phẩm phụ làm thay đổi pH của môi trường.
Đặc biệt trong thí nghiệm 3, thí nghiệm 4 và thí nghiệm 5 pH của môi trường tăng mạnh, từ pH ban đầu là 6,52; 7,03 và 7,51 khi kết thúc thí nghiệm pH của môi trường lên men lần lượt là 8,49; 8,50 và 8,49.
Như vậy, pH ban đầu 6,5 - 7,5 là phù hợp cho sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn MSS8.4.
3.4.1.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, sinh tổng hợp deltaendotoxin của chủng MSS8.4
Trong tự nhiên, vi sinh vật đƣợc phân thành 4 nhóm: vi sinh vật ƣa lạnh, vi sinh vật ƣa ấm và vi sinh vật ƣa nhiệt và vi sinh vật ƣa nhiệt cao (siêu nhiệt). Tùy thuộc nhóm vi sinh vật, mà nhiệt độ sinh trưởng khác nhau. Ở nhiệt độ thích hợp, vi sinh vật sinh trưởng mạnh, tạo nhiều sinh khối và các sản phẩm phụ. Ngược lại, nhiệt độ không thích hợp sẽ gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật, nhiệt độ quá thấp so với điều kiện tối ƣu, vi sinh vật có thể chuyển sang trạng thái ngủ, nhƣng ở nhiệt độ quá cao (trên 50, 60oC) có những chủng có thể tồn tại, sinh trưởng mạnh, nhƣng cũng có những chủng bị tiêu diệt ở ngay 45-50oC. Do vậy, cần xác định nhiệt độ tốt ƣu cho quá trình lên men. Thí nghiệm đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC. Kết quả nghiên cứu với chủng vi khuẩn MSS8.4 đƣợc trình bày ở Bảng 3.15.
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn MSS8.4
Nhiệt độ lên men (oC)
Mật độ TCC (CFU/ml)
Mật độ SC (CFU/ml)
Nồng độ protein tinh thể (mg/l)
117
20 7,5 x 107 6,3 x 107 445±22
25 3,8 x 108 3,0 x 108 528±11
30 4,39 x 108 4,14 x 108 541±16
35 3,5 x 108 3,2 x 108 524±21
40 9,5 x 107 8,9 x 107 415±21
45 1,6 x 107 9,2x106 214±8
Kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.15 cho thấy: nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng của chủng MSS8.4. Chủng MSS8.4 sinh trưởng mạnh nhất trong khoảng nhiệt độ từ 25 – 35oC, ở nhiệt độ này mật độ tế bào, bào tử đạt 4,39x108 CFU/ml, mật độ bào tử đạt 4,14x108 CFU/ml. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của Ngô Đình Bính và các cộng sự về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của B. thuringiensis. Theo đó, nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất của vi khuẩn Bt là 28±1oC (Ngô Đình Bính,2011; Tien và cộng sự, 2013;
Nguyễn Thị Vân Trang và cộng sự, 2012). Ở nhiệt độ dưới 20oC vi khuẩn B.
thuringiensis sinh trưởng chậm, trên 40oC bắt đầu ức chế sự sinh trưởng và hình thành bào tử của MSS8.4. Ở nhiệt độ 45oC, vi khuẩn MSS8.4 vẫn sinh trưởng được nhƣng sau 48 giờ lên mật độ bào tử và tế bào chỉ đạt 107CFU/ml (Bảng 3.15).
Tương tự như khả năng sinh trưởng, nồng độ protein tinh thể của MSS8.4 cũng chịu tác động mạnh mẽ từ nhiệt độ môi trường lên men, nồng độ protein tinh thể đạt đƣợc cao nhất ở 30oC (541 mg/l). Ở nhiệt độ thấp (20oC), sau 48 giờ lên men nồng độ delta endotoxin chỉ đạt 445 mg/l bằng 75% so với khi lên men ở 30oC. Ở nhiệt độ trên 40oC vi khuẩn MSS8.4 sinh trưởng chậm, mật độ bào tử tạo ra trong dịch canh trường lên men thấp và nồng độ protein tính thể trong dịch canh trường chỉ đạt 214 mg/l sau 48 giờ lên men ở 45oC.
Nhƣ vậy, xét về hiệu quả lên men, nhiệt độ phù hợp nhất là 30oC, tuy nhiên trong thực tế sản xuất nhiệt độ có thể dao động trong khoảng 25-35oC mà vẫn thu đƣợc mật độ bào tử và nồng độ protein mong muốn.
118 Sau khi nghiên cứu sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tiến hành lên men sản xuất 10 lit môi trường lên men theo phương pháp lên men chìm trong điều kiện pH=7, nhiệt độ: 30oC, lắc ở 200 vòng/phút trong thời gian 72 giờ.
Sau khi kết thúc lên men thu sinh khối và đặt trong tủ âm rồi tiến hành đông khô, thu đƣợc chế phẩm dạng bột.
Hình 3.27.Thiết bị lên men chế phẩm
Hình 3.28. Sinh khối thu đƣợc đặt trong tủ âm
119 Hình 3.29. Chế phẩm BT sau khi đông khô