– ðể phỏt hiện KST SR, tiờu bản mỏu phải ủược nhuộm. Phết mỏu ủược nhuộm càng sớm càng tốt vỡ việc nhuộm cũng giúp kéo dài thời gian bảo quản.
– Cú nhiều cỏch nhuộm, trong ủú cú 2 cỏch nhuộm phổ biến nhất:
+ Nhuộm Wright, trong ủú cú sẵn chất cố ủịnh, việc nhuộm và cố ủịnh xảy ra ủồng thời, do ủú phết mỏu dày phải ủược làm vỡ hồng cầu trước khi nhuộm.
+ Nhuộm Giemsa, chất cố ủịnh và thuốc nhuộm ủược tỏch riờng, vỡ vậy, phết mỏu mỏng phải ủược cố ủịnh với Methanol tuyệt ủối trước khi nhuộm.
– Ở Việt Nam, nhuộm Giemsa ủược dựng nhiều nhất.
1. DỤNG CỤ
2 lam kớnh và ủối chiếu với phiếu xột
nghiệm. kớnh và ủỳng với tờn trờn phiếu xột nghiệm.
3 Chọn vị trí lấy máu. ðầu ngón tay giữa hoặc áp út, hoặc gót chân.
4 Sỏt trựng ủầu ngún tay lấy mỏu. Phải sỏt trựng ủỳng quy cỏch và ủỳng vị trớ.
5 Chích máu.
Phải chờ da khô mới chích máu.
ðộng tác phải nhanh, dứt khoát, mạnh vừa phải ủể 1 giọt mỏu trào ra da sau khi chớch.
6 Bỏ giọt mỏu ủầu. Sạch, gọn.
7 Búp nhẹ ngún tay ủể mỏu trào ra. Lấy mỏu ủặt lờn lam kớnh.
Lượng máu nhiều gấp 3 lần phết làn máu mỏng. Giọt máu dày không quá gần phết làn máu mỏng .
8 ðể một góc lam kéo vào giữa giọt máu.
Xoay theo vòng tròn từ trung tâm ra ngoài, theo một chiều nhất ủịnh.
Mỏu phải ủược trải ủều, giọt mỏu phải trũn, cú ủường kớnh từ 1,2 -1,5cm.
9 ðể giọt máu khô trên mặt phẳng, tránh
bụi, cụn trựng. Giọt mỏu khụ tự nhiờn, cú màu ủỏ ủồng nhất, không có bụi, không bị nham nhở.
– Ống ủong cú chia ủộ với nhiều loại khỏc nhau: 10ml, 50ml, 100ml – Ống hút nhỏ giọt
– Cốc nhỏ 50 – 250ml – Khay
– Giỏ ủể nhuộm tiờu bản hoặc bỡnh nhuộm – Giỏ ủựng lam kớnh ủể hong khụ tiờu bản – ðồng hồ báo phút
– Quạt bàn loại nhỏ (ủể làm khụ tiờu bản) – Hộp ủựng tiờu bản
– Kẹp.
2. HÓA CHẤT
– Thuốc nhuộm Giemsa (dung dịch Giemsa mẹ) – Methanol
– Dung dịch ủệm phosphat pH 7 – 7,2.
Giemsa ủược cung cấp trờn thị trường ở 2 dạng: dạng bột hoặc dung dịch ủó pha sẵn.
2.1. Cách pha dung dịch Giemsa mẹ từ dạng bột – Thành phần:
– Cách pha:
Cho bột Giemsa vào trong cối với một ít Glycerin, dùng chày nghiền bột Giemsa với Glycerin cho tan hết bột thuốc nhuộm. Sau ủú cho thờm từ từ Glycerin vào nghiền nhiều lần cho tan ủều, cuối cựng cho Methanol vào.
Dung dịch Giemsa mẹ cần ủược ủựng trong chai thủy tinh màu trung tớnh, bảo quản chỗ khụ, mỏt và khụng cú ỏnh sỏng. Khi dựng pha loóng dung dịch Giemsa mẹ theo nồng ủộ quy ủịnh.
2.2. Dung dịch ủệm
– Nước trung tính hoặc hơi kiềm (pH khoảng 7 – 7,2).
– Dung dịch ủệm (dung dịch phosphat, pH = 7,2) gồm cú:
Thời hạn sử dụng dung dịch ủệm là vài tuần. Khi nào thấy cú cặn thỡ bỏ.
3. KỸ THUẬT NHUỘM TIÊU BẢN 3.1. Chuẩn bị tiêu bản
a) Làn máu mỏng
Trước khi nhuộm phải cố ủịnh bằng Methanol. Nhỳng lam mỏu vào bỡnh cú Methanol hoặc dựng ống hỳt nhỏ Methanol ủể phủ kớn làn mỏu mỏng, ủể tiờu bản khụ.
b) Giọt máu dày
Trước khi nhuộm phải phỏ vỡ hồng cầu, loại bỏ huyết sắc tố bằng dung dịch nhược trương vừa phải ủủ ủể phỏ vỡ hồng cầu nhưng phải giữ nguyờn KST SR. Dung dịch tẩy thường là dung dịch Giemsa pha loóng
1%, dung dịch ủệm hay nước cất.
Phủ dung dịch nhược trương lờn giọt mỏu dày, quan sỏt tới khi màu hồng của mỏu trụi ủi, ủể lại trờn tiờu bản 1 giọt mỏu màu vàng nhạt là ủược.
3.2. Quy trình nhuộm tiêu bản a) Nhuộm thường quy
ðặt giỏ nhuộm trờn khay nhuộm, ủể khay ở chỗ phẳng, sau ủú ủặt lam mỏu lờn giỏ nhuộm, mặt cú máu lên trên.
Pha dung dịch nhuộm Giemsa 3%: 3ml Giemsa mẹ + 97ml dung dịch ủệm.
Phủ kín dung dịch nhuộm lên giọt máu.
Thời gian nhuộm là 30 – 45 phút.
Rửa tiờu bản bằng nước cất hoặc nước trung tớnh: nhỳng sõu tiờu bản ủó nhuộm vào khay nước rửa, lấy tiờu bản ra nhẹ nhàng. Rửa như vậy vài lần, ủến khi nước rửa trong.
Cắm tiờu bản vào giỏ ủể hong khụ tự nhiờn, mặt mỏu quay xuống dưới ủể trỏnh bụi.
Chỉ khi nào tiờu bản thật khụ mới soi dưới kớnh hiển vi hoặc cất bảo quản trong hộp ủựng tiờu bản, muốn tiờu bản khụ nhanh dựng quạt, khụng dựng nhiệt ủộ.
Lưu ý khi rửa tiêu bản:
– Khụng nờn hất ủổ dung dịch nhuộm ủi rồi mới nhỳng tiờu bản vào khay rửa, như vậy cặn thuốc nhuộm
có thể bám lên tiêu bản.
– Tránh rửa tiêu bản giọt máu dày dưới vòi nước, vì có thể làm bong giọt máu.
b) Nhuộm nhanh
– Quy trình nhuộm giống như trên, nhưng pha dung dịch nhuộm Giemsa 10%: 10ml Giemsa mẹ + 90ml dung dịch ủệm.
– Thời gian nhuộm là 5 – 10 phút.
Có thể nhuộm tiêu bản trong bình nhuộm:
– ðổ ủầy dung dịch nhuộm vào bỡnh.
– Xếp tiờu bản mỏu ủó cố ủịnh (giọt mỏu mỏng) hoặc ủó làm vỡ hồng cầu (giọt mỏu dày) vào bỡnh ủể nhuộm.
4. NHẬN XÉT TIÊU BẢN NHUỘM TỐT
Tiêu bản nhuộm tốt, khi xem dưới kính hiển vi thấy như sau:
– Tiêu bản sạch, không cặn, không bụi.
– Hồng cầu bắt màu xanh tím hoặc xanh da trời, hoặc có màu hồng nhạt. Nếu có hồng cầu bị nhiễm KST SR, thấy cú những hạt sắc tố và hạt ủặc hiệu (hạt Schuffner, hạt Maurer).
– Bạch cầu ủơn nhõn cú màu xanh tớm.
– Tế bào chất của bạch cầu lympho có màu xanh lơ nhạt.
– Bạch cầu ỏi toan cú những hạt màu ủồng ủỏ rừ.
– Bạch cầu ủa nhõn trung tớnh cú những hạt to nhỏ, khụng ủều, màu xanh lơ tới ủỏ.
– KST SR cú hỡnh thể rừ ràng: nhõn thường bắt màu ủỏ sẫm hoặc ủỏ tớa, tế bào chất bắt màu xanh lơ, hạt sắc tố của ký sinh trựng bắt màu tớm sẫm hoặc màu nõu ủen.
5. BẢO QUẢN TIÊU BẢN
Tiêu bản nếu lưu lại lâu dài cần bảo quản tốt. Khi soi KST SR xong phải lau sạch dầu trên tiêu bản bằng cỏch ỳp tiờu bản lờn giấy thấm ủể loại bớt dầu, sau ủú nhỏ 1 – 2 giọt xylen lờn phớa trờn giọt mỏu rồi dựng khăn vải mềm, mỏng, sạch, lau nhẹ cho sạch. Tiờu bản ủể chỗ khụng cú ỏnh sỏng, tốt nhất là ủể trong hộp gỗ.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Anh (chị) hóy liệt kờ những dụng cụ cần ủể nhuộm tiờu bản mỏu bằng Giemsa.
2. Mô tả quy trình nhuộm Giemsa tiêu bản máu mỏng và dày.
3. Anh (chị) cho biết yếu tố nào làm cho tiờu bản nhuộm ủược ủẹp, thấy rừ cỏc chi tiết của KST SR.
4. Nờu tiờu chuẩn của một tiờu bản nhuộm ủẹp.
Nhuộm tiêu bản giọt máu mỏng
Stt Thao tỏc Yờu cầu phải ủạt
1 Chuẩn bị dụng cụ và húa chất ủể nhuộm
tiờu bản mỏu. Dụng cụ và húa chất ủầy ủủ ủể nhuộm tiờu
bản giọt máu dày.
2 Cố ủịnh tiờu bản mỏu bằng cồn
Methanol. Nhỳng trọn phần mỏu trải, khụng ủể lan ra
giọt máu dày.
3 Pha dung dịch nhuộm. Pha ủỳng cụng thức.
4 Nhuộm tiêu bản:
– ðặt tiêu bản lên giá nhuộm hoặc vào bình nhuộm.
– Phủ dung dịch Giemsa ủó pha
– Tiêu bản phải nằm bằng phẳng trên giá, không nghiêng.
– Thuốc nhuộm phủ kín giọt máu,
Nhuộm tiêu bản giọt máu dày
Bài 14