1. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP
Khi quan sỏt mẫu nấm dưới kớnh hiển vi, nếu thấy ủược nấm trong tiờu bản thỡ cú thể xỏc ủịnh người bệnh nhân ựó bị nhiễm nấm. đôi khi ta có thể ựịnh danh ựược loài nấm nếu ta thấy rõ các bào tử và những cấu trỳc ủặc biệt khỏc của một loại nấm.
Nhưng khi soi trực tiếp một mẫu bệnh phẩm mà không tìm thấy nấm, ta cũng không thể loại ngay khả năng nhiễm nấm. ðộ nhạy của mỗi phương phỏp thay ủổi tựy theo loại bệnh phẩm, vị trớ lấy bệnh phẩm, kinh nghiệm của người làm xét nghiệm.
1.1. Khảo sát với NaCl 0,85%
NaCl 0,85% ủược dựng với bệnh phẩm lỏng như huyết trắng, phết họng,…
Quy trình kỹ thuật:
Pha loãng bệnh phẩm trong dung dịch NaCl 0,85%.
Nhỏ 1 giọt bệnh phẩm pha loãng lên lam kính.
ðậy lá kính và soi dưới kính hiển vi với vật kính x10 và x40.
Khảo sỏt với ủộ sỏng khỏc nhau (kớnh tụ quang cao, thấp) ủể tỡm vi nấm dạng sợi hay hạt men.
1.2. Với KOH 10% hoặc 20%
– Dung dịch KOH hoặc NaOH dựng ủể khảo sỏt cỏc bệnh phẩm rắn hoặc ủậm ủặc (da, túc, múng, ủàm, da, mẩu sinh thiết mô,…).
– Dung dịch KOH làm mềm, căng giãn các tế bào, tan các hạt dầu, mỡ có trong bệnh phẩm.
Quy trình kỹ thuật:
Trên tấm lam kính sạch, khô, nhỏ 1 giọt KOH 10% hoặc 20%.
ðể mẫu thử vào giọt KOH, dầm nhỏ bệnh phẩm nếu là da hay trứng tóc.
ðậy lá kính.
ðể yờn 15 – 30 phỳt; hoặc nếu muốn khảo sỏt ngay, hơ tấm lam kớnh trờn ủốn cồn (khụng cho sụi).
Khảo sát với vật kính x10 và x40.
1.3. Khảo sát với dung dịch phẩm xanh Lacto Phenol Coton Blue (LPCB)
Thường ỏp dụng ủể khảo sỏt cỏc lứa cấy nấm, Acid lactic giữ vững cấu trỳc vi nấm, Phenol giết nấm, xanh Coton nhuộm màu vi nấm ủể dễ quan sỏt hơn.
a) Quy trình kỹ thuật
ðặt 1 mảnh khuẩn lạc nấm lên tấm lam kính sạch khô.
Nhỏ 1 – 2 giọt phẩm xanh LPCB.
Dùng kim cấy lấy lứa cấy dầm vào giọt dung dịch phẩm xanh LPCB.
ðậy lá kính.
Khảo sát dưới kính hiển vi.
Muốn lưu giữ tiêu bản, viền tiêu bản bằng keo sơn móng tay.
b) Kết quả: Các cấu trúc của vi nấm bắt màu xanh tím của Lacto Phenol Cotton blue.
2. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM 2.1. Nhuộm mực tàu
Thường dựng ủể khảo sỏt vi nấm cú nang, nhất là vi nấm Cryptococcus neoformans, mực tàu khụng thấm vào nang tạo một khoảng trống, trắng chung quanh tế bào vi nấm.
a) Quy trình kỹ thuật
Trên tấm lam kính sạch, khô, nhỏ 1 giọt mực tàu.
Nhỏ 1 giọt bệnh phẩm, hay lứa cấy lên giọt mực tàu.
ðốt kim cấy ủể nguội, trộn mực tàu và bệnh phẩm.
ðậy lỏ kớnh lờn giọt mực tàu ủó hũa với bệnh phẩm.
Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi.
Nếu nền mực tàu quỏ ủậm cú thể làm loóng bớt bằng 1 giọt nước cất.
b) Kết quả
Nếu trong bệnh phẩm cú Cryptococcus neoformans: tế bào nấm trũn hay bầu dục, bờn ngoài ủược bao bởi 1 nang lớn, nang khụng thấm màu, do ủú sỏng lờn trờn nền ủen của mực tàu.
2.2. Nhuộm Gram
Thường dựng ủể khảo sỏt cỏc bệnh phẩm dạng lỏng, ướt như: huyết trắng, mủ, ủàm, cặn lắng nước tiểu, phết họng,…
a) Quy trình kỹ thuật
b) Kết quả
Tất cả vi nấm bắt màu Gram dương.
Tuy nhiờn cú một số vi nấm khụng giữ màu tốt, do ủú cần dựng phương phỏp nhuộm Gram biến ủổi.
2.3. Nhuộm Giemsa
Chủ yếu nhuộm bệnh phẩm mỏu ngoại biờn, tủy xương ủể vi nấm trong tế bào như Histoplasma capsulatum, kỹ thuật nhuộm giống như nhuộm phết máu bình thường.
2.4. Nhuộm kháng acid
Nhuộm kháng acid khi muốn tìm Norcardia.
a) Quy trình kỹ thuật
Phết bệnh phẩm lờn lam kớnh, cố ủịnh bằng cỏch hơ núng.
Phủ Carbon fuchsin, ủể trong 3 phỳt.
ðổ bỏ Carbon fuchsin.
Nhỏ Acid sulfuric lờn tiờu bản cho ủến khi khụng cũn màu của Carbon fuchsin.
Phủ xanh Methylen, ủể trong 1 phỳt.
Rửa và hong khô.
Khảo sát với vật kính dầu.
b) Kết quả
Nocardia sp bắt màu ủỏ của Carbon fuchsin.
2.5. Nhuộm PAS (Periodic acid Schiff)
Phương phỏp này thường ủược sử dụng cho cỏc mẫu mụ bệnh phẩm tỡm vi nấm dạng sợi tơ và hạt men.
a) Quy trình kỹ thuật
b) Kết quả:
Vi nấm bắt màu ủỏ tớm.
Hiện nay, người ta dựng chất huỳnh quang ủể phỏt hiện nấm như thuốc nhuộm Calcifluor trắng phỏt hiện nấm nhanh, kể cả Pneumocystis carinii, xanh Toluidine nhuộm ủàm ủể tỡm P. carinii.
Bảng tóm tắt các phương pháp nhuộm tìm vi nấm trong bệnh phẩm Phương pháp
nhuộm
Chẩn đốn Thời gian Ưu điểm
Xanh Alcian Phỏt hiện Cryptococcus neoformans 2 phỳt Tỡm thấy trong DNT, cú Ít ủược dựng,
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Phương pháp khảo sát trực tiếp có thể áp dụng cho loại bệnh phẩm nào?
2. Anh (chị) cho biết cỏc loại bệnh phẩm nào thường phải dựng KOH ủể quan sỏt và tỏc dụng của dung dịch KOH.
3. Trình bày quy trình kỹ thuật làm tiêu bản nấm soi trực tiếp với KOH.
4. Phương pháp nhuộm Giemsa dùng cho loại bệnh phẩm nào và để chẩn đốn loại nấm nào?
trong DNT. nghĩa là bị viêm màng não.
Acid nhanh Phát hiện Mycobacteria và Nocardia sp.
12 phút Phát hiện Nocardia
và Blastomyces dermatitidis.
Khó nh mẫu mô.
Calcofluor Phát hiện nấm, P. carinii. 1 phút Phát hiện nhanh nhờ phát huỳnh quang.
đòi hỏ nhận dạ Giemsa Nhuộm tủy xương và phết máu
ngoại biên.
15 phút Phát hiện
Histoplasma capsulatum.
Thường ch
Histoplasma capsulatum.
Giemsa biến ủổi
Nhuộm ủàm và nước rửa phế quản.
13 phỳt Phỏt hiện thể hoạt ủộng của Pneumocystis carinii.
Không nhu P. carinii nấm khác.
Gram Phỏt hiện vi trựng. 3 phỳt Thường dựng ủể phỏt hiện vi trùng và vi nấm.
Tốt ủối v
nấm khác không ăn màu nh Nocardia sp giống n Mực tàu Phát hiện Cryptococcus neoformans
trong DNT.
1 phút Tìm thấy trong DNT, có nghĩa là bị viêm màng não.
ðộ nhạ
KOH Làm trong nấm. 5 phút
hoặc hơn
Phát hiện nhanh nấm. Người làm xét nghi kinh nghi
Xanh Methylen Phát hiện nấm trong da. 2 phút Thường thêm KOH ủể làm trong nấm, màu xanh giúp phát hiện nấm dễ hơn.
Mô nền nhận d
Methanamin bạc
Phát hiện nấm trong mẫu mô .
1 giờ Tốt ủể phỏt hiện nấm. Cần húa ch không có s ký sinh trùng.
Papanicolaou Phát hiện tế bào ác tính trong dịch tiết.
30 phỳt Cú thể phỏt hiện ủược nấm. Cần húa ch ủọc tiờu b PAS Phát hiện nấm nói chung. 20 - 25
phút
Nhuộm nấm rất tốt, thấy rõ sợi tơ nấm và hạt men.
Nocardia B. dermatitidis vật giả Xanh Toluidin Nhuộm ủàm và nước rửa
phế quản. Phát hiện nấm, P. carinii
25 phút Nhuộm bào nang P. carinii. Không nhu
Khỏng thể ủơn dòng gắn huỳnh quang
Nhuộm ủàm và nước rửa phế quản. Phát hiện nấm, P. carinii.
45 phút Phát hiện bào nang P. carinii. ðặc hiệ
Wright Nhuộm tủy xương và phết máu ngoại biên.
7 phút Phát hiện Histoplasma capsulatum.Thường ch
Histoplasma capsulatum.
5. Kỹ thuật soi với mực tàu ủược ỏp dụng cho cỏc loại vi nấm nào? Mụ tả quy trỡnh nhuộm và hỡnh ảnh của mầm bệnh trên tiêu bản nhuộm.
6. Kỹ thuật nhuộm PAS ủược ỏp dụng cho cỏc loại vi nấm nào? Mụ tả quy trỡnh nhuộm PAS và hỡnh ảnh của mầm bệnh trên tiêu bản nhuộm.
7. Theo anh (chị)) nhuộm Gram cĩ ích gì trong chẩn đốn vi nấm? Tại sao?
Xét nghiệm nấm trực tiếp với KOH
Phương pháp nhuộm mực tàu
Bài 23