- Sơ đồ bố trí thí nghiệm của đề tài:
Enzyme: Ce, Te, Fu, Dia
Car
Xác định khối lượng phân tử
Thủy phân
Xác định hoạt độ bằng pp Heinkel
Thủy phân Car
enzyme amylaseopt
[enzyme amylaseopt], nhiệt độ, pH, [Car], thời gian
Chọn chế độ thủy phân cĩ
mức độ thủy phân cần thiết Đo độ nhớt
Xác định khối lượng phân tử
- [enzyme amylaseopt]opt
- Nhiệt độopt
- pHopt
Khẳng định chế độ thủy phân thích hợp
Đánh giá sản phẩm thủy phân
Sấy phun
Phối chế
- [Car]opt
- Thời gianopt
- Xác định độ tan - Xác định cấu trúc ( 12C, 1H) - Xác định ATTP: độ sạch, kim loại nặng, vi sinh Xác định nồng độ dung dịch sấy; chất trợ sấy; tỷ lệ chất trợ sấy; nhiệt độ; tốc độ bơm; áp suất nén
Phụ gia: hương cam, màu cam, vitamin C, đường saccharose
Bao gĩi
2.2.6.1. Thăm dị loại enzyme amylase thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn
Để chọn enzyme amylase thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
Car 0,5%
Thủy phân
[enzyme]=0,2% pH: 6,0
Nhiệt độ: 40oC Thời gian: 2 giờ
Ter Fu Ce Dia (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đo độ nhớt
enzyme amylaseopt
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, tiến hành thủy phân Car bằng các enzyme amylase khác nhau trong điều kiện cố định các thơng số: nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme và thời gian thủy phân. Sau đĩ đánh giá mức độ thủy phân dựa vào độ nhớt, từ đĩ lựa chọn enzyme thủy phân Car thích hợp.
2.2.6.2. Nghiên cứu tìm thơng số thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn
Mục đích: thủy phân Car từ rong sụn và ứng dụng vào sản xuất trà hịa tan. Cụ thể: đưa Car về dạng Dexcar cĩ khả năng hịa tan tốt, cĩ hoạt tính sinh học cao ứng dụng sản xuất trà uống hịa tan. Để cĩ hoạt tính lớn nhất, Car phải cĩ khối lượng phân tử là 51.000-54.000 Da (trung bình 52.500 Da) theo Phạm Hồng Hải,
Để xác định được các thơng số thích hợp cho quá trình thủy phân Car bằng enzyme amylase phải tiến hành rất nhiều thí nghiệm. Việc xác định khối lượng phân tử trung bình của Car sau mỗi lần thí nghiệm sẽ rất phức tạp và khĩ khăn. Tuy nhiên, khối lượng phân tử trung bình của Car và độ nhớt của nĩ cĩ mối quan hệ với nhau theo phương trình: [16]
η =K.M α (Phương trình Mark-Houwik-Sakurada) Trong đĩ:
η: là độ nhớt
M: khối lượng phân tử trung bình K, α: hệ số thực nghiệm
Vì vậy, để cho đơn giản thay vì chọn khối lượng phân tử trung bình của Car làm chỉ tiêu để đánh giá chế độ thủy phân, chúng tơi chọn độ nhớt của dung dịch Car. Do độ nhớt gắn với khối lượng phân tử, do đĩ mức độ thủy phân dung dịch Car được xác định theo cơng thức:
(Độ nhớt mẫu trắng - Độ nhớt mẫu thí nghiệm) × 100
Mức độ thủy phân Car = (%)
Độ nhớt mẫu trắng
Sau khi đã xác định được thơng số cho mức độ thủy phân Car cần thiết được xác định theo cơng thức (2.2.6.2):
(Khối lượng phân tử Car nguyên liệu–52.500) × 100
Mức độ thủy phân Car cần thiết = (%)
Khối lượng phân tử Car nguyên liệu
Lúc này mới đi xác định khối lượng phân tử trung bình của Dexcar bằng phương pháp đo độ nhớt-phần 2.2 phụ lục 2.
Dung dịch Car sau khi thủy phân
Lọc
Kết tủa bằng cồn 700
Cơ quay chân khơng (470C)
Sấy khơ ở 600 (W=12%) Chế phẩm Dexcar
Xác định khối lượng phân tử trung bình
- Xác định nồng độ enzyme thủy phân thích hợp
Để chọn nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân Car, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
Car 0,5%
Thủy phân
pH= 6,0; τ=2h; nhiệt độ=400C
[enzyme amylaseopt] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0,1; 0,2 ; 0,3; 0,4%
Đo độ nhớt và chọn [enzyme amylase opt]opt
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, sẽ tiến hành thủy phân Car ở các nồng độ khác nhau của enzyme amylaseopt đã chọn ở trên, trong điều kiện cố định các thơng số: t0, pH, và thời gian thủy phân. Sau đĩ đánh giá mức độ thủy phân dựa vào độ nhớt, từ đĩ xác định nồng độ enzyme amylaseopt thích hợp.
- Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp
Để chọn được nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình thủy phân Car, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
Car 0,5%
Thủy phân
pH= 6,0; τ =2h; [enzyme amylaseopt]opt
Nhiệt độ
30; 40; 50; 60; 70; 80; 900C
Đo độ nhớt và chọn nhiệt độopt
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, tiến hành thủy phân Car ở các nhiệt độ khác nhau trong điều kiện cố định các thơng số: pH, [enzyme amylaseopt]opt và thời gian thủy phân. Sau đĩ đánh giá mức độ thủy phân dựa vào độ nhớt, từ đĩ xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp.
- Xác định pH thủy phân thích hợp
Để chọn được pH thích hợp cho quá trình thủy phân Car, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau: Car 0,5%
Thủy phân
τ =2h; [enzyme amylase opt]opt; Nhiệt độopt
pH
5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, tiến hành thủy phân Car ở các pH khác nhau trong điều kiện cố định các thơng số: [enzyme amylase opt]opt, Nhiệt độopt và thời gian thủy phân. Sau đĩ đánh giá mức độ thủy phân dựa vào độ nhớt, từ đĩ xác định pH thủy phân thích hợp.
- Xác định nồng độ Car thủy phân thích hợp
Car
Thủy phân
τ =2h; [enzyme amylase opt]opt; Nhiệt độopt; pHopt
Nồng độ Car
0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5%
Đo độ nhớt và chọn [Car]opt
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, tiến hành thủy phân Car ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện cố định các thơng số: [enzyme amylase opt]opt, nhiệt độopt, pHopt
và thời gian thủy phân. Sau đĩ đánh giá mức độ thủy phân dựa vào độ nhớt, từ đĩ xác định nồng độ Car thủy phân thích hợp.
- Xác định thời gian thủy phân thích hợp
Để xác định thời gian thủy phân Car thích hợp, bố trí thí nghiệm như sau: Car (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thủy phân
[enzyme amylase opt]opt; Nhiệt độopt; pHopt; [Car]opt
Thời gian
1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 (giờ)
Đo độ nhớt và xác định τ opt
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, tiến hành thủy phân Car ở các thời gian khác
nhau trong điều kiện cố định các thơng số: [enzyme amylase opt]opt; Nhiệt độopt; pHopt; [Car]opt. Sau đĩ đánh giá mức độ thủy phân dựa vào độ nhớt, từ đĩ xác định
thời gian thủy phân thích hợp để đi xác định khối lượng phân tử trung bình của Dexcar.
2.2.6.3. Bước đầu ứng dụng bột Car thủy phân để sản xuất trà uống hịa tan
Sau khi tham khảo các sản phẩm trà hịa tan và các sản phẩm đồ uống đã cĩ trên thị trường, chúng tơi dự kiến sản phẩm trà hịa tan Dexcar của đề tài cĩ đặc điểm chính sau:
Xác định một số thơng số cho cơng đoạn sấy phun
Đầu tiên dung dịch Dexcar được mang đi cơ đặc từ nồng độ 0,75 % đến nồng
độ thích hợp, sau đĩ đi xác định các thơng số thích hợp cho quá trình sấy phun.
- Xác định chất trợ sấy
Dung dịch Dexcar
Sấy phun với các
Áp suất khí nén: 3,5 bar
chất trợ sấy khác nhau Tốc độ bơm: 27,5ml/phút
Nhiệt độ sấy: 1550C Bổ sung 20% dextrin Bổ sung 20% maltodextrin
Nhận xét cảm quan – chọn chất trợ sấyopt
Trạng thái Tính tan Màu
- Xác định tỷ lệ chất trợ sấy
Dung dịch Dexcar
Áp suất khí nén: 3,5 bar
Sấy phun ở các tỷ lệ
chất trợ sấyopt khác nhau Tốc độ bơm: 27,5ml/phút Nhiệt độ sấy: 1550C
10% 20% 30% 40%
- NhXác định nhiquanđ– ấyọn tỷ lệ chất trợ sấy opt
Dung dịch Dexcar
Áp suất khí nén: 3,5 bar Sấy phun ở các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhiệt độ khác nhau (0C)
Tốc độ bơm: 27,5ml/phút
Chất trợ sấyopt với tỷ lệ bổ sung thích hợp
145 155 165 175
Nhận xét cảm quan – chọn nhiệt độ sấyopt
Xác định một số thơng số cho cơng đoạn phối trộn
Tùy vào thành phần và tỷ lệ phụ gia phối trộn, sẽ thu được trà Dexcar mang hương vị khác nhau.
- Xác định tỷ lệ đường saccharose: đường saccharose được xay nhuyễn thành dạng bột trước khi phối trộn với Dexcar.
- Xác định tỷ lệ bột màu vàng cam - Xác định tỷ lệ bột hương cam Mẫu A B C D Tỷ lệ % bột hương cam/bột Mẫu A B C D Mẫu A B C
- Xác định tỷ lệ bột vitamin C
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh hĩa, mỗi thí nghiệm làm 3 lần, mỗi lần kiểm tra 3 mẫu. Kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
Sử dụng phần mềm Microsoft office Excel để xử lý số liệu, với hệ số tương quan R2 ≥ 0,95.
Mẫu
A
B
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định độ hịa tan của Car nguyên liệu
Tiến hành xác định độ hịa tan của Car nguyên liệu (nội dung của phương pháp được trình bày tại phần 2.3 phụ lục 2), kết quả xác định cho thấy Car nguyên liệu cĩ độ hịa tan là 92,17%. Như vậy, độ hịa tan của Car nguyên liệu khá thấp. Do vậy, việc nghiên cứu thủy phân cắt mạch Car bằng enzyme amylase để đưa Car về dạng Dexcar cĩ độ hịa tan cao hơn nhằm ứng dụng vào sản xuất trà hịa tan là rất cần thiết.
3.2. Kết quả xác định khối lượng phân tử trung bình của Car nguyên liệu bằngphương pháp đo độ nhớt (nội dung của phương pháp được trình bày tại phần 2.2 phương pháp đo độ nhớt (nội dung của phương pháp được trình bày tại phần 2.2 phụ lục 2)
3.2.1. Xác định độ nhớt đặc trưng của Car nguyên liệu
Theo phương pháp này, để xác định độ nhớt đặc trưng của mẫu, trước hết xác định giá trị độ nhớt riêng phụ thuộc vào nồng độ của nĩ. Chúng tơi tiến hành như sau: pha mẫu Car nguyên liệu ở các nồng độ khác nhau theo dãy: 0,08; 0,16; 0,20; 0,24; 0,32 g/100ml. Sau đĩ xác định độ nhớt của từng mẫu bằng nhớt kế mao quản ở 200C. Kết quả trình bày trong bảng 3.15 phụ lục 1 và hình 3.1.
12 10 8 6 4 2 0 y = 23.603x + 3.4478 R2 = 0.9976 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ Car (g/100ml)
Hình 3.1. Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ của Car
Từ đồ thị trên ta xác định được độ nhớt đặc trưng của Car là: [η]= 344,78.
3.2.2. Tính giá trị khối lượng phân tử trung bình của Car nguyên liệu
Thay giá trị độ nhớt đặc trưng xác định được ở trên vào phương trình Mak- Huvin:
lg[η] = lgK + αlgM Trong đĩ:
[η]: độ nhớt đặc trưng, [η] = lim ηr C 0 C
K, α: hằng số đặc trưng cho hệ polymer-dung mơi M: khối lượng phân tử polymer
Với K= 8,84.10-3; α=0,86 theo Trần Thị Hồng, Tạp chí phân tích Hĩa, Lý và Sinh học, 10 (2), tr.57-59 [10]. Ta cĩ: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lg344,78= lg8,84.10-3 + 0,86 lgM M= 218.010 (Da)
So sánh với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác về xác định khối lượng phân tử trung bình của Car nhận thấy: theo kết quả nghiên cứu của tác giả Trần Thị Hồng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội [10] thì khối lượng phân tử trung bình của rong biển Việt Nam là 208.161 Da [10]; Cịn trong trong kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Phạm Hồng Hải, Nguyễn Xuân Nguyên, Nguyễn Bích Thủy, Trần Đình Toại thì khối lượng phân tử trung bình của Car chiết tách từ rong Hồng vân (Eucheuma gelatinea) là (250 ± 20).103 Da [7]. Như vậy, kết quả nghiên cứu trên cũng gần tương tự như kết quả nghiên cứu của tác giả khác.
Từ đĩ, cho phép đưa ra nhận xét: Car tách chiết từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty cĩ khối lượng phân tử trung bình gần bằng với Car chiết tách từ rong Hồng vân (Eucheuma gelatinea).
3.3. Kết quả thăm dị loại enzyme amylase thích hợp cho quá trình thủy phânCar từ rong sụn Car từ rong sụn
3.3.1. Kết quả xác định hoạt độ của enzyme amylase theo phương phápHeinkel (nội dung phương pháp được trình bày tại phần 2.1 phụ lục 2) Heinkel (nội dung phương pháp được trình bày tại phần 2.1 phụ lục 2)
Xác định hoạt độ của các enzyme amylase theo phương pháp Heinkel (nội dung của phương pháp được trình bày ở phần 2.1 phụ lục 2). Kết quả trình bày trong bảng 3.17 phụ lục 1 và hình 3.2.
11000 9500 8000 6500 5000 3500 2000 500 3900.7 7702.13 986.7 9308.51 Ce Fu Dia Te
Loại enzyme amylase
Hình 3.2. Hoạt độ của enzyme amylase
Từ kết quả xác định hoạt độ cho thấy Te cĩ hoạt độ cao nhất, sau đĩ đến Fu và thấp nhất là Dia. Cụ thể đơn vị hoạt động của Te gấp 2,38 lần Ce; 1,21 lần Fu và 9,43 lần Dia. Trong nghiên cứu về “khảo sát quá trình cố định enzym α - amylase (Te) bởi chất mang CMC-Alginate”, tác giả Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo - Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-TP.HCM dùng phương pháp Smith và Rose đã xác định được hoạt tính củaTer là 13333 (U/ml) [21]. Như vậy đơn vị hoạt độ Te trong đề tài xác định được bằng phương pháp Heinkel (11170,21 U/ml) thấp hơn khoảng 16% so với kết quả nghiên cứu của tác giả Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo. Cĩ điều này là do: các tác giả dùng phương pháp khác nhau để xác định hoạt độ Te.
3.3.2. Kết quả xác định mức độ thủy phân Car của Fu, Dia, Ce, Te
Hoạt độ của enzyme amylase xác định được ở trên theo phương pháp Heinkel với cơ chất chuẩn là tinh bột. Khi sử dụng enzyme amylase để thủy phân Car cần kiểm tra lại mức độ thủy phân của enzyme amylase trên cơ chất Car. Do vậy, chúng tơi đã tiến hành thử nghiệm xác định mức độ thủy phân Car của các enzyme trên. Tiến hành 4 thí nghiệm với Fu, Dia, Ce, Te với hàm lượng Te dùng
0,2% trên trọng lượng mẫu (w/w). Dựa vào kết quả tại bảng 3.18 phụ lục 1, ta cĩ lượng các enzyme cần dùng như sau:
Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ là 400C; pH là 6,0; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.19 phụ lục 1 và hình 3.3. 34 33 32 31 30 29 28 33.84 27 26 25.1 26.24 25.86 25 24 Ce Fu Dia Te
Loại enzyme amylase Hình 3.3. Mức độ thủy phân Car của Fu, Dia, Ce, Te
Từ kết quả thí nghiệm đã cho thấy: Te cho mức độ thủy phân Car cao nhất phù hợp với kết quả xác định hoạt độ enzyme trên cơ chất chuẩn là tinh bột bằng phương pháp Heinkel ở trên.
Do vậy từ các kết quả trên, chọn loại enzyme amylase thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là Te.
Enzyme Te
Fu
3.4. Kết quả xác định thơng số thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn
Thơng số thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn là thơng số để thủy phân cắt mạch Car, đưa Car cĩ khối lượng phân tử trung bình 218.010 Da (xác định ở phần 3.2) về dạng Dexcar cĩ khả năng hịa tan tốt, cĩ hoạt tính cao (khối lượng phân tử 51.000 ÷ 54.000 Da [7]) để sản xuất trà hịa tan. Như nhận xét ở phần trên, mức độ thủy phân Car cần thiết để thu được Dexcar cĩ khối lượng phân tử 51.000 ÷ 54.000 Da xác định theo cơng thức 2.2.6.2. Do vậy, ta cĩ:
Mức độ thủy phân Car cần thiết= (%)
(218.010 – 52.500) × 100
218.010 = 75,91 %
Đây là cơ sở để chọn chế độ thủy phân xác định khối lượng phân tử trung bình của Dexcar.
3.4.1. Kết quả xác định nồng độ enzyme thủy phân Car
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi tăng nồng độ enzyme, tốc độ phản ứng sẽ tăng nhưng mức độ tăng nồng độ enzyme cũng cĩ giới hạn vì khi tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm sẽ khơng cĩ hiệu quả trong thực tế sản xuất. Để xác định ảnh hưởng của nồng độ Te đến mức độ thủy phân Car, tiến hành 4 mẫu thí nghiệm với các nồng độ Te trong dung dịch thủy phân khác nhau: 0,1%÷0,4%. Trong đĩ, mẫu 1: nồng độ Te 0,1%; mẫu 2: nồng độ Te 0,2%; mẫu 3: nồng độ Te 0,3%; mẫu 4: nồng độ Te 0,4%. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện pH=6,0; nhiệt độ 400C; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định