phương pháp đo độ nhớt (nội dung của phương pháp được trình bày tại phần 2.2
phụ lục 2)
3.2.1. Xác định độ nhớt đặc trưng của Car nguyên liệu
Theo phương pháp này, để xác định độ nhớt đặc trưng của mẫu, trước hết xác định giá trị độ nhớt riêng phụ thuộc vào nồng độ của nĩ. Chúng tơi tiến hành như sau: pha mẫu Car nguyên liệu ở các nồng độ khác nhau theo dãy: 0,08; 0,16; 0,20; 0,24; 0,32 g/100ml. Sau đĩ xác định độ nhớt của từng mẫu bằng nhớt kế mao quản ở 200C. Kết quả trình bày trong bảng 3.15 phụ lục 1 và hình 3.1.
12 10 8 6 4 2 0 y = 23.603x + 3.4478 R2 = 0.9976 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ Car (g/100ml)
Hình 3.1. Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ của Car
Từ đồ thị trên ta xác định được độ nhớt đặc trưng của Car là: [η]= 344,78.
3.2.2. Tính giá trị khối lượng phân tử trung bình của Car nguyên liệu
Thay giá trị độ nhớt đặc trưng xác định được ở trên vào phương trình Mak- Huvin:
lg[η] = lgK + αlgM Trong đĩ:
[η]: độ nhớt đặc trưng, [η] = lim ηr
C 0 C
K, α: hằng số đặc trưng cho hệ polymer-dung mơi M: khối lượng phân tử polymer
Với K= 8,84.10-3; α=0,86 theo Trần Thị Hồng, Tạp chí phân tích Hĩa,
Lý và Sinh học, 10 (2), tr.57-59 [10]. Ta cĩ:
Lg344,78= lg8,84.10-3 + 0,86 lgM M= 218.010 (Da)
So sánh với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác về xác định khối lượng phân tử trung bình của Car nhận thấy: theo kết quả nghiên cứu của tác giả Trần Thị Hồng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội [10] thì khối lượng phân tử trung bình của rong biển Việt Nam là 208.161 Da [10]; Cịn trong trong kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Phạm Hồng Hải, Nguyễn Xuân Ngun, Nguyễn Bích Thủy, Trần Đình Toại thì khối lượng phân tử trung bình của Car chiết tách từ rong Hồng vân (Eucheuma gelatinea) là (250 ± 20).103 Da [7]. Như vậy, kết quả nghiên cứu trên cũng gần tương tự như kết quả nghiên cứu của tác giả khác.
Từ đĩ, cho phép đưa ra nhận xét: Car tách chiết từ rong sụn Kappaphycus
alvarezii (Doty) Doty cĩ khối lượng phân tử trung bình gần bằng với Car chiết tách
từ rong Hồng vân (Eucheuma gelatinea).
3.3. Kết quả thăm dị loại enzyme amylase thích hợp cho q trình thủy phân Car từ rong sụn
3.3.1. Kết quả xác định hoạt độ của enzyme amylase theo phương phápHeinkel (nội dung phương pháp được trình bày tại phần 2.1 phụ lục 2) Heinkel (nội dung phương pháp được trình bày tại phần 2.1 phụ lục 2)
Xác định hoạt độ của các enzyme amylase theo phương pháp Heinkel (nội dung của phương pháp được trình bày ở phần 2.1 phụ lục 2). Kết quả trình bày trong bảng 3.17 phụ lục 1 và hình 3.2.
11000 9500 8000 6500 5000 3500 2000 500 3900.7 7702.13 986.7 9308.51 Ce Fu Dia Te
Loại enzyme amylase
Hình 3.2. Hoạt độ của enzyme amylase
Từ kết quả xác định hoạt độ cho thấy Te cĩ hoạt độ cao nhất, sau đĩ đến Fu và thấp nhất là Dia. Cụ thể đơn vị hoạt động của Te gấp 2,38 lần Ce; 1,21 lần Fu và 9,43 lần Dia. Trong nghiên cứu về “khảo sát quá trình cố định enzym α - amylase (Te) bởi chất mang CMC-Alginate”, tác giả Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo - Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-TP.HCM dùng phương pháp Smith và Rose đã xác định được hoạt tính củaTer là 13333 (U/ml) [21]. Như vậy đơn vị hoạt độ Te trong đề tài xác định được bằng phương pháp Heinkel (11170,21 U/ml) thấp hơn khoảng 16% so với kết quả nghiên cứu của tác giả Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo. Cĩ điều này là do: các tác giả dùng phương pháp khác nhau để xác định hoạt độ Te.
3.3.2. Kết quả xác định mức độ thủy phân Car của Fu, Dia, Ce, Te
Hoạt độ của enzyme amylase xác định được ở trên theo phương pháp Heinkel với cơ chất chuẩn là tinh bột. Khi sử dụng enzyme amylase để thủy phân Car cần kiểm tra lại mức độ thủy phân của enzyme amylase trên cơ chất Car. Do vậy, chúng tơi đã tiến hành thử nghiệm xác định mức độ thủy phân Car của các enzyme trên. Tiến hành 4 thí nghiệm với Fu, Dia, Ce, Te với hàm lượng Te dùng
0,2% trên trọng lượng mẫu (w/w). Dựa vào kết quả tại bảng 3.18 phụ lục 1, ta cĩ lượng các enzyme cần dùng như sau:
Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ là 400C; pH là 6,0; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.19 phụ lục 1 và hình 3.3. 34 33 32 31 30 29 28 33.84 27 26 25.1 26.24 25.86 25 24 Ce Fu Dia Te
Loại enzyme amylase Hình 3.3. Mức độ thủy phân Car của Fu, Dia, Ce, Te
Từ kết quả thí nghiệm đã cho thấy: Te cho mức độ thủy phân Car cao nhất phù hợp với kết quả xác định hoạt độ enzyme trên cơ chất chuẩn là tinh bột bằng phương pháp Heinkel ở trên.
Do vậy từ các kết quả trên, chọn loại enzyme amylase thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là Te.
Enzyme Te
Fu
3.4. Kết quả xác định thơng số thích hợp cho q trình thủy phân Car từ rong sụn
Thơng số thích hợp cho q trình thủy phân Car từ rong sụn là thơng số để thủy phân cắt mạch Car, đưa Car cĩ khối lượng phân tử trung bình 218.010 Da (xác định ở phần 3.2) về dạng Dexcar cĩ khả năng hịa tan tốt, cĩ hoạt tính cao (khối lượng phân tử 51.000 ÷ 54.000 Da [7]) để sản xuất trà hịa tan. Như nhận xét ở phần trên, mức độ thủy phân Car cần thiết để thu được Dexcar cĩ khối lượng phân tử 51.000 ÷ 54.000 Da xác định theo cơng thức 2.2.6.2. Do vậy, ta cĩ:
Mức độ thủy phân Car cần thiết=
(%)
(218.010 – 52.500) × 100
218.010 = 75,91 %
Đây là cơ sở để chọn chế độ thủy phân xác định khối lượng phân tử trung bình của Dexcar.
3.4.1. Kết quả xác định nồng độ enzyme thủy phân Car
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi tăng nồng độ enzyme, tốc độ phản ứng sẽ tăng nhưng mức độ tăng nồng độ enzyme cũng cĩ giới hạn vì khi tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm sẽ khơng cĩ hiệu quả trong thực tế sản xuất. Để xác định ảnh hưởng của nồng độ Te đến mức độ thủy phân Car, tiến hành 4 mẫu thí nghiệm với các nồng độ Te trong dung dịch thủy phân khác nhau: 0,1%÷0,4%. Trong đĩ, mẫu 1: nồng độ Te 0,1%; mẫu 2: nồng độ Te 0,2%; mẫu 3: nồng độ Te 0,3%; mẫu 4: nồng độ Te 0,4%. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện pH=6,0; nhiệt độ 400C; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.20 phụ lục 1 và hình 3.4.
36 34 32 30 28 26 28.13 33.84 34.98 35.36 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ Te (%) Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ Te đến mức độ thủy phân Car
Từ kết quả các thí nghiệm cho thấy: khi nồng độ Te tăng trong khoảng 0,1 ÷ 0,2% thì mức độ thủy phân Car cũng tăng nhanh. Cụ thể với mẫu 1: nồng độ Te 0,1% thì mức độ thủy phân Car là 28,13%, mẫu 2: nồng độ Te 0,2% mức độ thủy phân Car là 33,84% tăng 5,71% so với mẫu Te 0,1%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ Te thì mức độ thủy phân Car tăng chậm. Cụ thể mẫu 3: nồng độ Te 0,3% thì mức độ thủy phân Car là 34,98% tăng 1,14% so với mẫu Te 0,2%; mẫu 4: nồng độ Te 0,4% thì mức độ thủy phân Car là 35,36% chỉ tăng 1,52% so với mẫu Te 0,2% .
Như vậy, từ kết quả trên cho thấy chọn nồng độ Te 0,2% là hợp lý. Vì nếu chúng ta tiếp tục tăng nồng độ Te thì mức độ thủy phân Car cũng tăng khơng đáng kể.
3.4.2. Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân Car
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp tới vận tốc phản ứng của enzyme. Nhiệt độ càng tăng thì vận tốc của phản ứng cĩ xúc tác enzyme càng tăng. Nhưng vì enzyme cĩ bản chất protein nên nhiệt độ chỉ tăng đến một mức độ giới hạn. Nếu vượt quá giới hạn này thì phản ứng sẽ giảm hoặc dừng lại do bản thân enzyme bị biến tính. Nhiệt độ mà ở đĩ tốc độ phản ứng đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ tối thích của enzyme khơng phải là hằng số mà nĩ cịn phụ thuộc
vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, pH mơi trường, nồng độ enzyme, nguồn enzyme. Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến mức độ thủy phân Car của Te, tiến hành 7 mẫu thí nghiệm với các nhiệt độ trong dung dịch thủy phân khác nhau: 300C ÷ 900C. Trong đĩ: mẫu 1: ứng với nhiệt độ 300C; mẫu 2: 400C; mẫu 3: 500C; mẫu 4: 600C; mẫu 5: 700C; mẫu 6: 800C; mẫu 7: 900C. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện pH=6,0; nồng độ Te=0,2%; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.21 phụ lục 1 và hình 3.5; 3.6.
+ Trường hợp khơng bổ sung Ca2+
42 40 40.68 39.54 38 37.26 38.02 37.64 36 34 32 30 28 30.79 33.84 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ (0C) Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân Car
+ Trường hợp bổ sung 40 ppm Ca2+ 52 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 30.41 33.46 37.64 42.58 48.28 49.8 50.57 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ (0C) Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân Car (40 ppmCa2+)
Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy:
+ Với trường hợp khơng bổ sung 40 ppm Ca2+: khi nhiệt độ tăng trong khoảng 30÷600C thì mức độ thủy phân Car cũng tăng nhanh. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên trên 600C thì mức độ thủy phân Car lại giảm dần.
+ Với trường hợp bổ sung 40 ppm Ca2+: khi nhiệt độ tăng trong khoảng 30 ÷ 900C thì mức độ thủy phân Car cũng tăng nhanh, đặc biệt trong khoảng nhiệt độ 40
÷ 700C và khi nhiệt độ lớn hơn 700C thì mức độ thủy phân Car tăng chậm lại. So sánh hai trường hợp khơng bổ sung Ca2+ và cĩ bổ sung 40ppm Ca2+ nhận thấy ở dải nhiệt độ từ 30÷500C thì trường hợp khơng bổ sung Ca2+ và cĩ bổ sung 40ppm Ca2+ cĩ mức độ thủy phân Car là gần tương đương nhau. Tuy nhiên, khi nhiệt độ thủy phân tăng lên trên 500C thì mức độ thủy phân Car trong trường hợp cĩ bổ sung Ca2+ tăng nhiều hơn trường hợp khơng bổ sung Ca2+. Đặc biệt, khi nhiệt độ
thủy phân lớn hơn 600C thì mức độ thủy phân Car cĩ sự khác biệt rõ rệt giữa trường hợp cĩ bổ sung 40ppm Ca2+ và trường hợp khơng bổ sung Ca2+: với trường hợp cĩ bổ sung canxi, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì mức độ thủy phân Car vẫn tăng lên; cịn trường hợp khơng cĩ bổ sung thêm canxi thì khi tăng nhiệt độ lên mức độ thủy phân lại giảm dần.
Như vậy, từ kết quả trên cho thấy, chọn nhiệt độ thủy phân Car 800C và cĩ bổ sung thêm 40ppm Ca2+ là hợp lý. Vì nếu chúng ta tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân lên thì mức độ thủy phân Car cũng tăng khơng đáng kể. Mặt khác khi thủy phân Car ở nhiệt độ cao sẽ ảnh hưởng nhiều hơn đến chất lượng của sản phẩm. Cịn nếu chọn nhiệt độ thấp hơn sẽ phải kéo dài thời gian thủy phân hơn để đạt được mức độ thủy phân cần thiết.
So sánh với nhiệt độ thủy phân của các enzyme khác như cellulase từ xạ khuẩn (nhiệt độ thủy phân thích hợp là 550C), enzyme papain (nhiệt độ thủy phân thích hợp là 750C) từ nhựa quả Đu Đủ trong các nghiên cứu của tác giả GS.TS. Trần Thị Luyến hay nghiên cứu quá trình thủy phân thịt cá Mối bằng enzyme protease từ vi khuẩn B. subtilis S5 của TS. Vũ Ngọc Bội (nhiệt độ thủy phân thích hợp là 500C) cho thấy nhiệt độ thủy phân của Te là khá cao (800C). Tính bền nhiệt của α-amylase cĩ được là do sự cĩ mặt của canxi trong phân tử enzyme, ở đây canxi giữ vai trị ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme.
3.4.3. Kết quả xác định pH thủy phân Car
Mỗi loại enzyme sẽ cĩ hoạt tính cao nhất ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme. pH ảnh hưởng tới hoạt tính xác tác của enzyme, do nĩ làm thay đổi trạng thái ion hĩa các nhĩm định chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, cĩ thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme. Nĩ cũng cĩ thể làm thay đổi trạng thái ion hĩa của cơ chất làm ảnh hưởng tới khả năng hình thành hợp chất trung gian. Để xác định ảnh hưởng của pH thủy phân đến mức độ thủy phân Car, tiến hành 5 mẫu thí nghiệm với các pH trong dung dịch thủy phân khác nhau:
pH=5,5 ÷ 7,5. Trong đĩ, mẫu 1: ứng với pH=5,5; mẫu 2: pH=6,0; mẫu 3: pH=6,5; mẫu 4: pH=7,0; mẫu 5: pH=7,5. Các mẫu thủy phân đều tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ thủy phân Car là 800C và cĩ bổ sung thêm 40ppm Ca2+; nồng độ Te=0,2%; nồng độ dung dịch Car là 0,5%. Sau thời gian 2 giờ, lấy mẫu đi xác định độ nhớt trên máy Fann với tốc độ quay 600v/p tại nhiệt độ 300C. Kết quả trình bày trong bảng 3.22 phụ lục 1 và hình 3.7. 56 54 52 50 47.9 49.8 51.33 50.19 48.66 48 46 44 42 40 5.5 6 6.5 7 7.5 pH
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân Car
Từ kết quả các thí nghiệm đã cho thấy khi thủy phân Car với pH=6,5 thì cho mức độ thủy phân Car là cao nhất. Cụ thể với mẫu 3: pH=6,5 thì mức độ thủy phân Car là 51,33 %. Khi thủy phân ở pH cao hơn hoặc thấp hơn 6,5 thì mức độ thủy phân Car đều bị giảm, và thủy phân ở pH càng xa với pH=6,5 thì mức độ thủy phân Car càng bị giảm nhiều hơn. Cụ thể mẫu 1: pH thủy phân là pH=5,5 thì mức độ thủy phân Car là 47,90 % giảm 3,43% so với mẫu pH=6,5; mẫu 2: pH thủy phân là pH=6,0 thì mức độ thủy phân Car là 49,80 % giảm 1,53% so với mẫu pH=6,5; mẫu 4: pH thủy phân là pH=7,0 thì mức độ thủy phân Car là 50,19 % giảm 1,14% so với mẫu pH=6,5; mẫu 5: pH thủy phân là pH=7,5 thì mức độ thủy phân Car là 48,66 % giảm 2,76% so với mẫu pH=6,5.
Như vậy, từ kết quả trên cho thấy, chọn thủy phân Car với pH=6,5 là hợp lý. Vì nếu chúng ta tăng hay giảm pH thủy phân thì mức độ thủy phân Car đều giảm.
So sánh với các nghiên cứu của GS.TS Trần Thị Luyến và các cộng sự về pH thích hợp cho thủy phân chitin của một số enzyme như cellulase (pH=5,2);
Hemicellulase thương mại (pH=5,5); enzyme papain (pH=5,5). Kết quả cho thấy pH thích hợp cho q trình thủy phân Car bằng Te cao hơn so với với pH của các enzyme cellulase, hemicellulase, papain.
pH trên gần tương tự với pH thích hợp cho enzyme amylase từ nấm mốc
Asp.oryzae. Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hĩa và
đường hĩa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6÷6,2. Cịn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hĩa của nĩ là 6,0÷7,0. Chứng tỏ các enzyme α-amylase nĩi chung hoạt động thủy phân tốt ở vùng acid yếu.
3.4.4. Kết quả xác định nồng độ Car thủy phân
Trong phản ứng thủy phân Car, cĩ sự hình thành phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất (ES), tiếp đĩ mới cĩ sự chuyển hĩa trong phức chất để tạo ra sản phẩm và giải phĩng enzyme ở dạng tự do. Tốc độ phản ứng thủy phân tỷ lệ với nồng độ của phức chất trung gian, vì vậy nồng độ cơ chất cĩ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ của phản ứng cĩ enzyme xúc tác. Để xác định ảnh hưởng của nồng độ Car đến mức độ thủy phân Car, tiến hành 6 mẫu thí nghiệm với các nồng độ dung dịch Car thủy phân khác nhau 0,25÷1,5%. Trong đĩ mẫu 1: ứng với [Car]=0,25%; mẫu