VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu thành phần rệp sáp và diễn biến tỷ lệ cành cà phê bị rệp sáp hại tại Tây Nguyên
2.3.1.1. Điều tra xác định thành phần rệp sáp hại cà phê tại Tây Nguyên Xác định khu vực điều tra
- Địa điểm điều tra được chọn: Một số nông trường và công ty trồng cà phê trọng điểm của các huyện thường xuyên có dịch rệp sáp, và một số huyện khác,... diện tích điều tra từ vài ngàn m2 hoặc từ 2-3 ha tuỳ theo vườn
- Để thu thập được tương đối đầy đủ thành phần rệp sáp hại cà phê, khu vực điều tra cần xác định sao cho thể hiện được tính đa dạng của sản xuất, bao gồm:
+ Các địa điểm (huyện) khác nhau bao gồm: TP. Buôn Ma Thuột (Xã Hòa Thắng), huyện Cưkuin (Công ty Cà phê Việt Đức), huyện Krông Pắk (Công ty Cà phê tháng 10), huyện Chư Sê (thị trấn Chư Sê).
+ Các vườn cà phê có độ tuổi khác nhau (vườn ở thời kỳ kiến thiết cơ bản và thời kỳ kinh doanh).
Lấy điểm điều tra
- Áp dụng theo phương pháp: lấy điểm theo 5 đường cheó góc, phân
bố đều trong khắp khu vực điều tra để thu được đầy đủ thành phần rệp hại có trong vườn.
Quan sát, phát hiện và thu thập mẫu vật
- Quan sát toàn bộ cây để phát hiện những dấu vết bị hại do rệp
- Những cây có hiện tượng không bình thường như sinh trưởng còi cọc vàng héo, muội đen, những cây có kiến ở gốc cần đào bới xuống đất để quan sát phần rễ.
Phương pháp thu thập mẫu vật:
- Tiến hành điều tra, ghi nhận và thu thập tất cả các bộ phận của cây có triệu chứng rệp sáp hại như thân cành, lá, rễ, quả.
- Phương pháp tiến hành: mỗi khu vực chọn 2 vườn, mỗi vườn điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 1 cây, trên mỗi cây điều tra 12 cành phân đều theo 4 hướng và 3 tầng (tầng gốc, tầng giữa và tầng ngọn). Trên mỗi cành chia làm 3 đoạn để lấy mẫu: đoạn gốc cành (đoạn cành không mang lá), đoạn giữa (đoạn cành mang quả), đoạn ngoài cùng (đoạn non chưa mang quả), thu tất cả các mẫu cho vào túi ni lông có dán mép, đem về phòng rửa bằng dung dịch cồn 5%, dùng pipet hút tất cả rệp ra, ngâm mẫu trong cồn 75%, mẫu được bảo quản trong phòng thí nghiệm
Điều tra bổ sung ở các địa điểm khác
- Để phát hiện đầy đủ thành phần rệp sáp hại và có thêm phạm vi phân bố của chúng, ngoài việc điều tra thường xuyên tại các địa điểm quy định cần tiến hành điều tra bổ sung thêm ở các địa điểm khác, đặc biệt là ở vùng có điều kiện sinh thái đặc thù.
- Đối với những loài rệp sáp quan trọng cần tranh thủ thu thập thêm các số liệu về mặt tác hại, mật độ sâu..
- Thời gian điều tra bổ sung tiến hành vào lúc cây ra lộc, ra hoa, quả non hoặc vào lúc rệp sáp phát triển nhiều.
2.3.1.2. Điều tra diễn biến tỷ lệ cành cà phê bị hại do một số loài rệp sáp chính trên cà phê tại Tây Nguyên
Tiến hành điều tra tại 4 địa điểm đại diện cho vùng sản xuất cà phê tại Đắk Lắk bao gồm: TP. Buôn Ma Thuột, huyện Krông Pắk, huyện Cưkuin và huyện Chư sê – Gia Lai.
Tại mỗi điểm điều tra, định kỳ điều tra mỗi tuần 1 lần, tiến hành điều tra diễn biến của 2 loài rệp hại chính trên hai loại vườn cà phê đó là vườn kiến thiết cơ bản (dưới 5 tuổi) và vườn ở thời kỳ kinh doanh (trên 10 tuổi). Với mỗi vườn chúng tôi điều tra tại 5 điểm, mỗi điểm điều tra 1 cây, mỗi cây điều tra chia thành 3 tầng: tầng gốc, tầng giữa và tầng ngọn, mỗi tầng điều tra 4 cành theo 4 hướng, mỗi cành điều tra chia thành 3 đoạn: Đoạn gốc, đoạn giữa và đoạn ngoài.
Chỉ tiờu theo dừi:
+ Thời gian phát sinh
+ Tính tỷ lệ cành bị nhiễm rệp
2.3.2. Điều tra thu thập, phân lập, giám định và định loại các chủng nấm ký sinh
2.3.2.1. Thu thập, phân lập và giám định các chủng nấm côn trùng
Phương pháp điều tra khảo sát thực địa: Điều tra các tác nhân sinh học có ích ngoài tự nhiên theo phương pháp điều tra cơ bản. Xác định các mẫu rệp sáp bị nấm ký sinh bằng phương pháp quan sát ban đầu các mẫu vật theo triệu chứng của nấm côn trùng như: Bề mặt có lớp bào tử, côn trùng ký chủ bị triệu chứng chết cứng… Mẫu vật thu thập được bảo quản riêng trong các ống túyp có nút bông đã được khử trùng sau đó đem về phòng thí nghiệm bảo quản ở nhiệt độ 40C để sau đó lựa chọn và phân lập.
Phân lập nấm theo phương pháp của Barnett và Hunter (1972) và theo phương pháp thường quy của Viện Bảo vệ thực vật. Tiến hành phân lập theo 3 cách:
- Cách 1: Khử trùng bề mặt mẫu vật bằng dung dịch cồn 50% trong 30 giây, sau đó nghiền mẫu trong cối sứ, thêm 1 đến 5 ml nước vô trùng, dùng micro pipet hút 0,1 ml cho vào đĩa môi trường và dùng trang thủy tinh trang kín bề mặt.
- Cách 2: Với mẫu vật có lớp bào tử nấm bên ngoài được quan sát là sạch thì tiến hành dùng que cấy lấy bào tử trên bề mặt côn trùng ký chủ và cấy trực tiếp vào đĩa môi trường.
- Cách 3: Dùng dao mổ cắt mẫu vật thành các mảnh nhỏ và lấy các mảnh nhỏ đặt lên bề mặt môi trường.
Môi trường dùng trong phân lập bao gồm Sabauraud, N1, N2 và Czapek-Dox.
* Phương pháp giám định loài bằng công nghệ DNA Tách chiết ADN
Vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Lấy 1 vòng que cấy khuẩn ty vào ống eppendorf vụ trựng, thờm 500 àl 2ìSSC vào mỗi ống. Lắc đều và giữ ở 99°C trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vụ trựng. Thờm khoảng 100 àl hạt thủy tinh cú đường kớnh 0,2 - 0,5 mm (Roth, Đức), 100 àl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 àl nước cất vụ trựng. Lắc ở 1400 vũng/phỳt trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN sau khi tách chiết được giữ ở -20°C.
Định tên vi sinh vật bằng giải trình tự
Phân đoạn rADN của vi sinh vật được khuyếch đại bằng mồi ITS1, NL4 trên thiết bị GeneAmp® PCRSystem 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) với chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 94°C trong 2 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52 °C trong 30 giây và 72 °C
trong 1 phút). Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72 °C trong 7 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10 °C.
Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại được tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của hãng. Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit (Hall, 1999) và so sánh bằng ClustalX (Thompson et al., 1997).
Danh sách các mồi sử dụng trong phân loại
ITS1 5’ to 3’: TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4 5’ to 3’: GGTCCGTGTTTCAAGACGG
2.3.2.2. Thí nghiệm lựa chọn môi trường nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy trên 5 loại môi trường, mỗi loại môi trường được nuôi cấy trên bình tam giác 500 ml và nhắc lại 5 lần, nuôi cấy trong 7 ngày được đặt trên máy lắc ở tốc độ 250 vòng/phút. Sau 7 ngày nuôi cấy tiến hành tách triết enzyme và đánh giá enzyme trên 5 cơ chất khác nhau bao gồm:
Chitine-T, chitine-C, lipid, cellulose và glucose. Sợi nấm và bào tử trồi được thu lại và đem sấy khô đến trọng lượng không đổi để đánh giá khả năng phát triển sinh khối.
- Nghiên cứu đánh giá xác định bộ chủng giống nấm có hoạt tính cao trên cơ sở xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể sau đó tiến hành tách triết dịch enzyme và thử trên các cơ chất bao gồm: Chitine, lipid, cenllulose và glucose bằng phương pháp đục lỗ có đường
kính 1cm trên môi trường thạch có chứa cơ chất và nhỏ dịch enzyme đầy lỗ thạch để sau 16h và dùng thuốc thử để xác định đường kính vòng phân giải.
2.3.2.3. Nghiên cứu khả năng phát triển của các chủng nấm ở các mức nhiệt độ khác nhau
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát của các chủng nấm: Các chủng nấm được cấy trên môi trường N1 trong đĩa Petri, mỗi chủng cấy 100 đĩa, cấy 1 điểm ở chớnh giữa đĩa. Theo dừi sự phỏt triển của nấm bằng mắt thường. Tiến hành theo dừi sự phỏt triển của khuẩn lạc thụng qua việc đo đường kớnh khuẩn lạc qua cỏc ngày theo dừi, đếm lượng bào tử và so sỏnh giữa các chủng.
Các đĩa sau khi cấy được đặt trong tủ định ôn ở các mức nhiệt độ thí nghiệm là 150C, 200C, 250C, 300C và 350C. Sau đú theo dừi sự phỏt triển của nấm thông qua việc đo đường kính và đếm số bào tử sau 3; 5; 7; 10 và 15 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiờu theo dừi
- Đường kính khuẩn lạc.
- Số lượng bào tử hình thành
Phương pháp đếm bào tử: Dùng buồng đếm hồng cầu và được tiến hành như sau:
Nghiền 1 cm2 khuẩn lạc nấm vào 10 ml nước cất và lắc đều, lấy 1 ml dịch bào tử vừa pha cho vào 9 ml nước cất, cứ hòa như vậy với tỷ lệ 1 ml dịch bào tử với 9 ml nước cất cho đến khi đếm được bào tử (10-4 – 106)
2.3.2.4. Đánh giá và tuyển chọn độc lực các chủng nấm côn trùng - Đánh giá độc lực của các chủng nấm bằng enzyme ngoại bào
Sau khi lắc trên môi trường dịch thể sau các ngày nuôi cấy N1, tiến hành thu dịch thể có chứa enzym ngoại bào. Sử dụng môi trường đệm Citrat photphat để thử khả năng hình thành một số enzym ngoại bào của nấm.
Thành phần (g/l)
Na2HPO4.12H2O 0.615g
Axit citric 0.25g
Agar 2g
Nước cất 100ml
Bổ sung mỗi loại 0.1 % (Tween 80, giấy lọc, vỏ tôm, vỏ cua, Glucoza) vào từng bình môi trường .
Khử trùng 1 atm/30’ sau đó đổ ra đĩa petri, để thạch nguội sau đó khoan thạch và nhỏ dịch nuôi vi nấm (dịch enzym thử) vào các lỗ khoan. ủ ở 28- 300C trong 16 giờ, tráng bằng thuốc thử lugol lên bề mặt thạch để cho tới khi xuất hiện vòng. Đổ thuốc thử đi và đo vòng phân giải
Vòng phân giải được tính toán theo công thức sau Vòng phân giải = (D-d) mm
D: Đường kính vòng phân giải d: Đường kính lỗ khoan.
- Đánh giá độc lực của các chủng nấm trên cơ thể rệp sáp
Các chủng sau khi đã lựa chọn có khả năng sinh enzyme cao được đánh giá trên cơ thể rệp sáp bằng phương pháp đánh giá độc lực của các chủng nấm (Viện BVTV, 1997, 1998). Tiến hành nhân nuôi loài rệp tua ngắn (Planococcus kraunhiae Kuwana) trong phòng thí nghiệm bằng thức ăn ưa thích của loài rệp này là quả bí ngô và củ khoai tây, trước ngày thí nghiệm tiến hành áp sát các củ khoai tây vào quả bí nuôi rệp để rệp di chuyển sang, sau đó loại bỏ bớt để cho đủ 50 rệp tuổi 2 trên mỗi củ khoai tây, để tiếp 1 ngày cho rệp ổn định và tiến hành thử nghiệm.
+ Mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 50 cá thể rệp + Thử nghiệm khả năng gây bệnh của nấm đối với rệp sáp, chúng tôi sử dụng các chủng nấm sau khi đã được đánh giá hoạt tính của enzyme.
+ Phương pháp: Đổ 10 ml nước cất vào mỗi ống nghiệm có chứa nấm,
dùng que cấy gạt bào tử trên bề mặt của thạch để hòa tan bào tử vào nước và đổ vào cốc đựng.
+ Đếm số lượng bào tử và pha tới nồng độ 107, có bổ sung chất bám dính với nồng độ 0,3 phần vạn.
- Sử dụng bình phun tay để phun dịch bào tử nấm ướt đều bề mặt trên củ khoai tây nuôi rệp.
Chỉ tiờu theo dừi:
Số rệp chết sau các ngày thử nghiệm
2.3.2.5. Nghiên cứu các phương pháp bảo quản các chủng giống gốc
Cấy các chủng giống gốc trong ống môi trường N1 và để ở 250C trong 7 ngày để các chủng nấm hình thành bào tử. Mỗi công thức cho mỗi chủng cấy 100 ống.
Sau đó tiến hành bảo quản bằng 3 phương pháp:
- Bảo quản thường: Các ống giống sẽ được đặt trong điều kiện tủ lạnh 40C.
- Bảo quản hút chân không: hút chân không trong 1 tuần để không còn tồn tại không khí trong bảo quản, sau đó đặt trong điều kiện 40C.
- Bảo quản bằng glyceryl: Đổ dung dịch glyceryl 5% ngập hết bề mặt của ống giống nấm đã cấy, sau đó đặt trong điều kiện 40C.
Sau thời gian bảo quản, 3 tháng 1 lần lấy giống ra và pha loãng ở nồng độ 10-5 và cấy lại trên môi trường, sau đó 3-5 ngày đếm số bào tử mọc mầm.
Chỉ tiờu theo dừi: Số bào tử nảy mầm
2.3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống rệp sáp hại cà phê
2.3.3.1. Thí nghiệm lựa chọn môi trường lên men xốp
Xác định môi trường sản xuất chế phẩm tối ưu, vừa thích hợp cho sự phát triển của nấm, vừa tận dụng được phế thải nông sản rẻ tiền.
Tiến hành thí nghiệm trên 5 công thức giá thể nuôi cấy khác nhau:
- CT1: Giá thể gạo: 100%
- CT2: Giá thể gạo + Ngô: 50 – 50 - CT3: Giá thể ngô: 100%
- CT4: Giá thể gạo + bã mía: 50 – 50 - CT5: Giá thể bã mía: 100%
Sau khi cấy nấm trên 5 loại giá thể trên, sau 7 ngày tiến hành sấy khô và lấy mẫu 1gr chế phẩm để đếm số lượng bào tử của từng công thức.
Chỉ tiờu theo dừi: Số lượng bào tử/gr chế phẩm
2.3.3.2. Nghiên cứu một số dạng phụ gia thích hợp để tạo dạng và kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm
Sau khi nhân sinh khối và tách chiết bào tử tinh của nấm, tiến hành nghiên cứu các dạng phụ gia để tạo dạng chế phẩm đảm bảo chất lượng cao nhất và kéo dài thời gian bảo quản. Chúng tôi lựa chọn và xác định 3 loại phụ gia để tiến hành thí nghiệm, 3 loại phụ gia này chúng tôi chuẩn bị đăng ký bản quyền sở hữu trớ tuệ nờn xin phộp khụng nờu rừ thành phần mà ký hiệu là PG1, PG2, PG3.
Các dạng phụ gia được phối trộn với bào tử tinh theo 3 tỷ lệ về trọng lượng như sau:
CT1: Bào tử nấm
CT2: Bào tử nấm – Phụ gia: 1/6 CT3: Bào tử nấm – Phụ gia: 1/9 CT4: Bào tử nấm – Phụ gia: 1/12
Sau khi phối trộn phụ gia và đóng gói, tiến hành bảo quản ở điều kiện thường (phòng thí nghiệm), sau mỗi tháng bảo quản tiến hành lấy mẫu và kiểm tra chất lượng chế phẩm sau các tháng bảo quản bằng phương pháp pha loãng đến 10-5 và cấy trên các đĩa môi trường N1. Chất lượng chế phẩm được
đánh giá thông qua chỉ tiêu số lượng bào tử sống/gr chế phẩm.
Chỉ tiờu theo dừi: Số lượng bào tử nảy mầm.
2.3.3.3. Nghiên cứu hỗn hợp chất bám dính khi sử dụng chế phẩm
Để tìm hiểu ảnh hưởng của các chất bám dính đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm khi hỗn hợp với chúng trong sử dụng phun rải trên đồng ruộng, chúng tôi tiến hành đánh giá trên môi trường nuôi cấy để biết được khả năng nảy mầm của bào tử. Hỗn hợp nồng độ của 3 loại chất bám dính là Tween 80, Enomil và nước rửa chén Sunligh theo khuyến cáo của nhà sản xuất là 0,3 phần vạn, bổ sung vào môi trường và sau đó dung dịch hòa từ chế phẩm ở nồng độ 10-5 vào các đĩa, đặt trong điều kiện định ôn 250C trong 5 ngày và tiến hành đếm số lượng bào tử nảy mầm.
Chỉ tiờu theo dừi: Số lượng bào tử nảy mầm.
2.3.3.4. Nghiên cứu đề xuất các bước trong quy trình sản xuất chế phẩm - Công đoạn 1: Sản xuất giống cấp 1
Giống cấp 1 được cấy trên môi trường N1 hoặc Sabauraud trong ống nghiệm ở điều kiện phòng từ 5 đến 7 ngày. Khi bề mặt hình thành và phủ kín lớp bào tử là đủ tiêu chuẩn để đưa vào sản xuất giống cấp 2.
- Công đoạn 2: Giống cấp 2
Sử dụng gạo đã luộc và sấy khô, cân 120gr cho vào trong bình tam giác 500ml thêm 60ml nước dung dịch CaCO30,5%, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Để nguội môi trường và cấy giống cấp 1 vào và nuôi ở điều kiện phòng (20 – 300C) từ 5 đến 7 ngày.
- Công đoạn 3: Nhân sinh khối
Cân 200gr gạo trong mỗi túi nilon chịu nhiệt có cổ túi và nút bông, thêm 70ml nước vào mỗi túi, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Để nguội và cấy giống cấp 2 vào.
Nuôi cấy trong điều kiện phòng sau 4 ngày thì tiến hành mở nút cổ túi
để thoáng khí sau đó 3 ngày tiến hành đổ ra nia ở độ dầy 3cm, tiếp tục để hình thành bào tử trong 2 ngày sau đó đem sấy.
- Công đoạn 4: Sấy chế phẩm
Sấy trong tủ sấy có đuổi khí ở điều kiện 380C trong 5– 8 giờ, kiểm tra thủy phần tới 8% là đạt. Với chế phẩm tinh thì tiếp tục công đoạn 5 (tách triết bào tử), còn chế phẩm thô thì tiếp theo công đoạn 6.
- Công đoạn 5: Tách chiết bào tử
Đổ chế phẩm đã sấy khô vào máy tách chiết bào tử để thu bào tử tinh.
Dùng máy tách bào tử có mặt sàng 0,3 mm đặt trên máy lắc ngang tốc độ 200 lần/phút, thu bào tử tinh từ phễu thu dưới mặt sàng.
- Công đoạn 6: Kiểm tra chất lượng chế phẩm
Lấy mẫu 1gr chế phẩm pha loãng ở 10-5 và cấy 0,1ml dịch nên đĩa môi trường nuôi cấy N1 hoặc Sabauraud đặt ở 280C trong 5 ngày để đếm số bào tử sống.
- Công đoạn 7: Đóng gói và bảo quản chế phẩm
+ Với sản phẩm thô: Đóng gói và bảo quản trong điều kiện phòng.
+ Với sản phẩm tinh (bào tử tinh): Trộn với phụ gia PG1 với tỷ lệ 10%
bào tử và 90% phụ gia, sau đó đóng gói và bảo quản.
2.3.4. Khảo nghiệm chế phẩm và xây dựng mô hình đánh giá hiệu quả phòng chống rệp sáp hại cà phê
2.3.4.1. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm trong phòng thí nghiệm
- Phương pháp nhân nuôi rệp sáp trong phòng thí nghiệm: Theo phương pháp nhân nuôi của Quách Thị Ngọ và cs., (2004). Rệp sáp là loài đa thực nên khi nhân nuôi trong phòng thí nghiệm với số lượng lớn tiến hành nhân nuôi trên quả bí đỏ hoặc trên củ khoai tây.
- Địa điểm đánh giá: Tại Viện Bảo vệ thực vật và Tại Viện Khoa học Nông lâm nghiệp Tây Nguyên.