KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống rệp sáp hại cà phê
3.3.1. Kết quả lựa chọn môi trường lên men xốp thích hợp
Để xác định môi trường sản xuất chế phẩm tối ưu, vừa thích hợp cho sự phát triển của nấm, vừa tận dụng được phế thải nông sản rẻ tiền, chúng tôi tiến hành phối trộn bã mía vào các công thức khác nhau.
Bảng 3.21. Khả năng sinh bào tử của chủng BR5 loài Beauveria bassiana và chủng MR4 loài Metarhizium anisopliae trên một số môi trường
sản xuất (Viện BVTV, 2010) Chủng
nấm
Mật độ bào tử (x109/gr)
LSD
5% CV % Gạo Gạo +
Ngô(50:50)
Gạo + Bã
mía(50:50) Ngô Bã mía
BR5 3,36a 2,27b 3,10a 3,16a 1,17c 0,51 14,1 MR4 1,89a 1,70a 1,54ab 1,40b 0,89c 0,32 16,9 Ghi chú: Trong phạm vi hàng, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05
Thông qua thí nghiệm trên chúng tôi nhân thấy: Bã mía là vật liệu có thể sử dụng để sản xuất chế phẩm, đặc biệt trong công thức hỗn hợp giữa gạo và bã mía theo tỷ lệ 50:50 thì nấm phát triển tương đối tốt và đạt hàm lượng bào tử đối với nấm BR5 là 3,10 x 109 bào tử/gr, nấm MR4 là 1,54 x 109 bào tử/gr. Tuy nhiên khi sản phẩm đem vào tách triết bào tử tinh và phun ngoài đồng ruộng gặp khó khăn vì khi giá thể là bã mía sấy khô, chúng sẽ gẫy vụn tăm mía ra và làm tắc mặt sàng của máy tách bào tử và làm tắc vòi của bình phun thuốc, sản phẩm này chỉ thích hợp khi ứng dụng sản phẩm thô để trừ dịch hại sống trong đất. Giá thể tốt nhất cho việc tách triết bào tử tinh và ứng dụng phun trên đồng ruộng là gạo.
3.3.2. Nghiên cứu một số dạng phụ gia thích hợp để tạo dạng và kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm
Sau khi nhân sinh khối và tách chiết bào tử tinh chủng MR4, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các dạng phụ gia để tạo dạng chế phẩm đảm bảo chất lượng cao nhất. Các dạng phụ gia được phối trộn với bào tử tinh theo tỷ lệ 10% khối lượng bào tử và 90% khối lượng phụ gia. Kiểm tra chất lượng chế phẩm tinh sau các tháng bảo quản (chất lượng chế phẩm được đánh giá thông qua chỉ tiêu số lượng bào sống/gr chế phẩm).
Bảng 3.22. Chất lượng chế phẩm tinh sau các tháng bảo quản khi phối trộn với các dạng phụ gia khác nhau (Viện BVTV, 2010 – 2011)
Thời gian bảo quản
Số bào tử sống/gr chế phẩm (x1012)
BBT BTT+PG1 BTT+PG2 BTT+PG3
Ban đầu 4,79a 0,47a 0,48a 0,47a
1 tháng 4,65a 0,46a 0,45b 0,44ab
2 tháng 3,98b 0,44b 0,43c 0,42abc
3 tháng 3,31c 0,42b 0,41d 0,37bcd
4 tháng 2,86d 0,40c 0,38e 0,34cd
5 tháng 1,73e 0,38d 0,36f 0,34cd
6 tháng 0,33f 0,37d 0,32g 0,30d
7 tháng 0g 0,34e 0,28h 0,11e
8 tháng 0g 0,31f 0,23i 0,09ef
9 tháng 0g 0,28g 0,18j 0f
10 tháng 0g 0,26h 0k 0f
11 tháng 0g 0,24i 0k 0f
12 tháng 0g 0,22j 0k 0f
CV% 7,9 2,9 3,1 3,5
Ghi chú: BTT: Bào tử tinh PG: Phụ gia
Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.22 cho thấy, bào tử tinh khi phối trộn với phụ gia 1 cho thời gian bảo quản kéo dài nhất, trước khi đem vào bảo quản hàm lượng bào tử sống là 0,47x1012 bào tử/gr chế phẩm,
sau 12 tháng bảo quản hàm lượng bào tử sống vẫn đạt 0,22x1012 bào tử/gr.
dạng phụ gia 2 và 3 khi phối trộn thời gian bảo quản kém hơn. Bào tử tinh nguyên chất bảo quản được rất ngắn, số liệu ban đầu trước khi bảo quản là 4,79 x 1012 bào tử/gr, sau 6 tháng bảo quản chỉ còn 0,33 x1012 bào tử/gr. Theo đánh giá của nhiều nhà khoa học thì thời gian bảo quản chế phẩm là tồn tại chung của các loại thuốc trừ dịch hại có nguồn gốc sinh học cần được khắc phục để có thể ứng dụng rộng rãi sản phẩm ra thị trường và đến tay người sản xuất (Nguyễn Văn Tuất – Báo cáo tổng hợp chương trình KC04-12).
Sau khi nghiên cứu và lựa chọn được dạng phụ gia thích hợp, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tỷ lệ phối trộn giữa bào tử tinh của chế phẩm với phụ gia theo 3 tỷ lệ về trọng lượng bào tử tinh/phụ gia để tạo dạng chế phẩm nâng cao thời gian bảo quản, kết quả thể hiện tại bảng 3.23.
Bảng 3.23. Chất lượng chế phẩm sau các tháng bảo quản
khi phối trộn với phụ gia ở các tỷ lệ khác nhau (Viện BVTV, 2010 – 2011) Thời gian
bảo quản
Số bào tử sống/gr chế phẩm sau thời gian bảo quản (x1012)
1/6 1/9 1/12
Ban đầu 0,66a 0,47a 0,35a
1 tháng 0,63a 0,46a 0,35a
2 tháng 0,54b 0,44b 0,33b
3 tháng 0,35c 0,42b 0,31c
4 tháng 0,26d 0,40c 0,30d
5 tháng 0,16e 0,38d 0,28e
6 tháng 0,05f 0,37d 0,27f
7 tháng 0,01g 0,34e 0,25g
8 tháng 0,00g 0,31f 0,23h
9 tháng 0,00g 0,28g 0,21i
10 tháng 0,00g 0,26h 0,19j
11 tháng 0,00g 0,24i 0,18k
12 tháng 0,00g 0,22j 0,16l
CV % 9,8 2,9 1,7
Ở tỷ lệ phối trộn 1/9 và 1/12 theo trọng lượng bào tử tinh/phụ gia, sau 12 tháng bảo quản ở công thức 1/9 số lượng bào tử sống là 0,22 x 1012 bào tử/gr và ở công thức 1/12 là 0,16 x 1012 bào tử/gr, trong khi ở tỷ lệ 1/6 đến tháng thứ 8 chế phẩm đã bị hỏng hoàn toàn. Như vậy, phối trộn bào tử tinh với phụ gia 1 ở tỷ lệ 1/9 hoặc 1/12 sẽ kéo dài được thời gian bảo quản chế phẩm tinh (bảng 3.23).
3.3.3. Nghiên cứu hỗn hợp chất bám dính khi sử dụng chế phẩm
Để tìm hiểu ảnh hưởng của các chất bám dính đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm khi hỗn hợp với chúng trong sử dụng phun rải trên đồng ruộng, chúng tôi tiến hành đánh giá trên môi trường nuôi cấy để biết được khả năng nảy mầm của bào tử với 3 loại chất bám dính ở nồng độ 0,3 phần vạn.
Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của một số chất bám dính đến sự nảy mầm của bào tử nấm MR4 và BR5 (Viện BVTV, 2011)
Chế phẩm BIOFUN 1 (MR4) Chế phẩm BIOFUN 2 (BR5) Công thức
Số bào tử nảy mầm/gr chế phẩm (x109)
Công thức
Số bào tử nảy mầm/gr chế phẩm (x109) Đ/C1 riêng BIOFUN 1 4,04a Đ/C2 riêng BIOFUN 2 5,57a CT2: BIOFUN 1+Enomil
(qua khử trùng)
3,48b BIOFUN 2+Enomil (qua khử trùng)
3,40c BIOFUN 1+E (không qua
khử trùng)
1,90c BIOFUN 2+E (không qua khử trùng)
1,56d BIOFUN 1+Tween (khử
trùng)
4,00a BIOFUN 2+Tween (khử trùng)
5,00b BIOFUN 1+Tw (không
khử trùng)
4,03a BIOFUN 2+Tw (không khử trùng)
5,27ab BIOFUN 1+Sunligh (khử
trùng)
4,02a BIOFUN 2+Sunligh (khử trùng)
5,34ab BIOFUN 1 +Sunligh
(không khử trùng)
4,00a BIOFUN 2+Sunligh (không khử trùng)
5,28ab
CV% 4,4 CV% 5,2
Ghi chú: Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05
Qua kết quả thí nghiệm bảng 3.24 cho ta thấy, hỗn hợp chế BIOFUN 1 với Tween hoặc nước rửa chén Sunligh cho hiệu quả cao nhất và đạt hàm lượng 4,03 x 109 và 4,02 x 109 số bào tử nảy mầm so với 4,04 x 109 bào tử nảy mầm ở công thức không hỗn hợp với bám dính, chế phẩm BIOFUN 2 với Tween không qua khử trùng hoặc nước rửa chén Sunligh cũng cho hiệu quả cao nhất và đạt hàm lượng bào tử nảy mầm là 5,27 x 109 và 5,34 x 109 số bào tử nảy mầm/gr sản phẩm so với 5,57 x 109 số bào tử nảy mầm ở công thức không hỗn hợp với chất bám dính.
3.3.4. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm
Qua các kết quả thí nghiệm về công nghệ sản xuất, cùng với sự kế thừa của các kết quả nghiên cứu trước, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học để phòng trừ rệp sáp như sau:
QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC BIOFUN 1 (MR4) VÀ BIOFUN 2 (BR5) ĐỂ PHềNG CHỐNG RỆP SÁP HẠI CÀ PHấ
NỘI DUNG QUY TRÌNH 1. Sản xuất giống cấp 1
Giống cấp 1 được sử dụng môi trường nuôi cấy là N1 hoặc Sabauraud trong ống nghiệm ở điều kiện phòng từ 5 đến 7 ngày. Khi bề mặt hình thành và phủ kín lớp bào tử là đủ tiêu chuẩn để đưa vào sản xuất giống cấp 2.
2. Giống cấp 2
Sử dụng gạo đã luộc và sấy khô, cân 120gr trong bình tam giác 500ml thêm 60ml nước CaCO3 0,5%, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Để nguội môi trường và cấy giống cấp 1 vào và nuôi ở điều kiện phòng từ 5 đến 7 ngày.
3. Nhân sinh khối
Cân 200gr gạo trong mỗi túi nilon chịu nhiệt có cổ túi và nút bông, thêm 70ml nước vào mỗi túi, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Để nguội và
cấy giống cấp 2 vào.
Nuôi cấy trong điều kiện phòng (20 – 280C) sau 4 ngày thì tiến hành mở nút cổ túi để thoáng khí sau đó 3 ngày tiến hành đổ ra nia ở độ dầy 3cm, tiếp tục để hình thành bào tử trong 2 ngày sau đó đem sấy.
4. Sấy chế phẩm
Sấy trong tủ sấy có đuổi khí ở điều kiện 380C trong 5– 8 giờ, kiểm tra thủy phần tới 8% là đạt. Với chế phẩm tinh thì tiếp tục công đoạn 5 (tách triết bào tử), còn chế phẩm thô thì tiếp theo công đoạn 6.
5. Tách chiết bào tử
Đổ chế phẩm đã sấy khô vào máy tách chiết bào tử để thu bào tử tinh.
Dùng máy tách bào tử có mặt sàng 0,3 mm đặt trên máy lắc ngang tốc độ 200 lần/phút, thu bào tử tinh từ phễu thu dưới mặt sàng.
6. Kiểm tra chất lượng chế phẩm
Lấy mẫu 1gr chế phẩm pha loãng ở 10-5 và cấy 0,1ml dịch nên đĩa môi trường nuôi cấy N1 hoặc Sabauraud đặt ở 280C trong 5 ngày để đếm số bào tử sống.
7. Đóng gói và bảo quản chế phẩm
7.1. Với sản phẩm thô: Đóng gói và bảo quản trong điều kiện phòng.
7.2. Với sản phẩm tinh (bào tử tinh): Trộn với phụ gia 1 (PG1) với tỷ lệ 10% trọng lượng bào tử sau đó đóng gói và bảo quản.
11. Phân phối, sử dụng
Khi vận chuyển cần tránh tiếp xúc với nơi có nhiệt độ cao (bào tử sẽ chết ở điều kiện 490C), tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp và tránh tiếp xúc với ẩm độ cao.
SƠ ĐỒ TểM TẮT QUY TRèNH Thu thập nguồn rệp sáp nhiễm
nấm bệnh ngoài tự nhiên Lựa chọn các mẫu điển hình
Phân lập Giám định
Đánh giá lựa chọn chủng Đánh giá bằng khả năng sinh emzyme ngoại bào
Đánh giá bằng khả năng lây nhiễm lại trên rệp
sáp
Sản xuất giống cấp 1
Sản xuất giống cấp 2 Nhân sinh khối
Sấy chế phẩm
Tách chiết bào tử
Kiểm tra chất lượng Kiểm tra chất lượng
Phối trộn phụ gia
Đóng gói Đóng gói
Phân phối, sử dụng
Hình 3.21. Giống nấm cấp 1 Hình 3.22. Giống nấm cấp 2
Hình 3.23. Nhân sinh khối
3.4. Khảo nghiệm chế phẩm và xây dựng mô hình đánh giá hiệu quả