KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2.1. Thu thập, phân lập và giám định các chủng nấm ký sinh trên sâu hạ
- Nghiên cứu diễn biến về tỷ lệ nấm ký sinh tự nhiên trên đồng ruộng: Trong năm 2010, cùng với điều tra diễn biến tỷ lệ cành cà phê bị rệp sáp hại, chúng tôi tiến hành điều tra về tỷ lệ rệp sáp bị nấm ký sinh trên đồng ruộng,
kết quả điều tra trên đồng ruộng chúng tôi nhóm chung các loài nấm và tính tỷ lệ chung, vì trên đồng ruộng không thể phân biệt được các loài nấm ký sinh ngay. Kết quả điều tra chúng tôi trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tỷ lệ cành cà phê bị nhiễm rệp sáp và tỷ lệ rệp sáp xanh mềm bị nấm ký sinh trên trên đồng ruộng tại Buôn Ma Thuột năm 2010
Ngày điều tra
Vườn kiết thiết cơ bản Vườn kinh doanh Tỷ lệ cành cà phê nhiễm rệp mềm xanh (%) Tỷ lệ rệp sáp xanh mềm bị nấm ký sinh tự nhiên (%) Tỷ lệ cành cà phê nhiễm rệp mềm xanh (%) Tỷ lệ rệp sáp xanh mềm bị nấm ký sinh tự nhiên (%) 19/1/2010 42,22 16,47 0,13 6,07 2/2/2010 63,33 15,56 3,33 17,21 3/3/2010 62,22 13,7 6,66 14,33 16/3/2010 78,89 26,47 13,3 24,53 30/3/2010 64,44 22,89 13,3 21,67 13/4/2010 50,07 36,53 6,66 38,56 27/4/2010 42,22 53,68 3,33 55,70 11/5/2010 32,22 55,12 0,17 44,27 25/5/2010 22,22 45,13 1,11 43,47 8/6/2010 17,78 47,34 1,11 48,22 22/6/2010 21,11 41,94 3,33 44,13 6/7/2010 34,44 36,33 6,66 35,37 20/7/2010 47,78 40,31 1,11 41,47 3/8/2010 68,89 52,43 3,33 50,91 17/8/2010 67,78 50,34 6,66 48,94 31/8/2010 57,78 67,22 13,3 64,72 14/9/2010 51,11 57,32 20,3 55,47 28/9/2010 63,33 44,65 13,3 47,12 12/10/2010 55,56 48,93 6,66 49,96 26/10/2010 51,11 25,68 3,33 26,24 9/11/2010 48,89 23,67 1,11 24,17
Kết quả điều tra cho thấy: Nhìn chung tỷ lệ nấm ký sinh trên rệp sáp mềm xanh ngoài đồng ruộng rất cao, có những quần thể rệp bị nhiễm nấm 100%. Diễn biến của nấm ký sinh trong năm trên đồng ruộng cũng khác nhau, chúng phụ thuộc nhiều vào ẩm độ, đặc biệt qua điều tra theo dõi sau những cơn mưa kéo dài ngày thì tỷ lệ nấm tăng đột biến. Trong điều kiên thời tiết từ tháng 1 đến tháng 3, tỷ lệ nấm ký sinh trên đồng ruộng có thấp hơn, sau đó từ tháng 4 tỷ lệ này tăng lên, tuy nhiên có những đợt giảm xuống do thời tiết nhiều ngày không mưa. Tỷ lệ rệp bị nấm ký sinh đạt cao nhất ngoài tự nhiên là 67,22 vào cuối tháng 8. Điều này cho thấy nấm ký sinh đóng vai trò rất lớn trong việc hạn chế số lượng trong quần thể rệp sáp.
Hình 3.7. Rệp sáp mềm xanh bị nấm ký sinh trên đồng ruộng tại Đắk Lắk, năm 2009
- Điều tra thu thập nguồn rệp sáp bị nấm ký sinh tại các vùng trồng nhiều cà phê bao gồm các huyện: Krông Păk, CưKuin, CưMga, Buôn Hồ và TP. Buôn Ma Thuột – Đắk Lắk, huyện Đắk Mil – Đắk Nông, huyện Chư Sê – Gia Lai. Ngoài ra chúng tôi có điều tra thu thập bổ sung nguồn từ các vùng trồng cà phê khác như huyện Nghĩa Đàn và thị xã Thái Hòa – Nghệ An,
huyện Thuận Châu và TP. Sơn La – Sơn La và một số nguồn trên các ký chủ khác ở các vùng khác nhau. Kết quả thu thập được với số lượng mẫu rất phong phú, sau khi lựa chọn các mẫu điển hình để đem về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập, và giám định loài bằng phương pháp hình thái học kết hợp với phân tích DNA. Kết quả phân lập và giám định như sau:
+ Giám định bằng hình thái: Sau khi nuôi cấy các chủng nấm trên môi trường N1 sau 5 ngày, tiến hành lấy các mẫu cành bào tử để soi trên kính hiển vi để giám định loài. Kết quả mô tả hình thái một số chủng như sau:
Chủng MR1:
- Khuẩn lạc:
Màu sắc mặt phải: Xanh rêu kèm ánh vàng, gần giống màu mai cua, dạng bông xốp, khi già màu trở nên đậm hơn. Trên bề mặt xuất hiện những đám sợi khí sinh màu trắng.
Mặt trái khuẩn lạc: Trắng ngà, khi già ngả sang màu nâu nhạt.
Tốc độ mọc: Mọc nhanh, đạt kích thước 4-5cm sau 4-5 ngày nuôi cấy, sau đó lan kín hộp Peptri. Tạo những rãnh đồng tâm với sự hình thành các đám bào tử và các sợi khí sinh xen kẽ.
- Cơ quan sinh bào tử: Cuống sinh bào tử: không màu, phân nhánh dị thường, tạo thành các cụm cuống sinh bào tử dày đặc. Kích thước đạt tới 200 x 3,5-4 µm, các tế bào sinh bào tử dạng chai, kích thước 2-2,5 x 8-12 µm.
Bào tử dạng phialo, tạo thành lên thành lớp dày đặc, hình , kích
thước 3-3,5µm.
Đây là hình dạng điển hình của loài nấm Metarhizium anisopliae
Chủng MR2 – MR9:
- Khuẩn lạc:
Màu sắc mặt phải: Xanh rêu đậm, khi già màu trở nên đậm hơn. Trên bề mặt xuất hiện những đám sợi khí sinh màu trắng.
Mặt trái khuẩn lạc: Trắng ngà, khi già ngả sang màu đậm hơn.
Tốc độ mọc: Mọc nhanh, đạt kích thước 3-3,5 cm sau 4-5 ngày nuôi cấy. Tạo những rãnh đồng tâm với sự hình thành các đám bào tử và các sợi khí sinh xen kẽ.
- Cơ quan sinh bào tử: Cuống sinh bào tử: không màu, phân nhánh dị thường, tạo thành các cụm cuống sinh bào tử dày đặc. Kích thước đạt tới 200 x 3,5-4 µm, các tế bào sinh bào tử dạng chai, kích thước 2-2,5 x 8-12µm.
Bào tử dạng phialo, tạo thành lên thành lớp dày đặc, hình , kích thước 3-3,5µm.
Đây là hình dạng điển hình của loài Metarhizium anisopliae
Chủng BR1, BR2:
Mô tả: Về hình dạng khuẩn lạc và cơ quan sinh bào tử hai chủng BR1 và BR2 có những đặc điểm phân loại giống nhau hoàn toàn như sau:
- Khuẩn lạc:
Màu sắc mặt phải: Khuẩn lạc màu trắng hoàn toàn, dạng bông xốp. Mặt trái khuẩn lạc: Trắng ngà, khi già ngả sang màu đậm hơn.
Tốc độ mọc: Mọc nhanh, đạt kích thước 3-3,5 cm sau 4-5 ngày nuôi cấy. Tạo những rãnh đồng tâm.
- Cơ quan sinh bào tử: Cuống sinh bào tử sinh ra từ sợi khí sinh với các đặc điểm: ngắn, phần cuống phình to, phần ngọn thót lại, từ đó sinh ra các bào tử nhỏ hình cầu đến hình elip, kích thước 2,5-3,5µm.
Đây là hình dạng điển hình của loài Beauveria bassiana
Chủng BR3-BR6, BR8 – BR11, BR13 – BR14:
- Khuẩn lạc:
Màu sắc mặt phải: Khuẩn lạc màu trắng hoàn toàn, dạng bông xốp. Mặt trái khuẩn lạc: Trắng ngà, khi già ngả sang màu đậm hơn.
Tốc độ mọc: Mọc nhanh, đạt kích thước 3-3,5 cm sau 4-5 ngày nuôi cấy. Tạo những rãnh đồng tâm.
- Cơ quan sinh bào tử: Trên môi trường nuôi cấy, các đám bào tử hình quả bóng được sinh ra dày đặc, trên đó hình thành các cụm cuống sinh bào tử ngắn, phần cuống phình to, phần ngọn thót lại, từ đó sinh ra các bào tử nhỏ hình cầu đến hình elip, kích thước 2,5-3,5µm.
Đây là hình dạng điển hình của loài Beauveria bassiana
Một số hình ảnh về rệp sáp bị nhiễm nấm ký sinh Hình 3.8. Rệp sáp bột tua ngắn bị nấm Metarhizium ký sinh Hình 3.9. Rệp sáp bột tua ngắn bị nấm Beauveria ký sinh Hình 3.10. Rệp sáp mềm xanh bị nấm ký sinh Hình 3.11. Rệp sáp bột 2 tua dài bị nấm Metarhizium ký sinh
Một số hình ảnh về khuẩn lạc và cành bào tử các chủng nấm
Hình 3.12. Khuẩn lạc chủng MR1 Hình 3.13. Cuống sinh bào tử chủng MR1
Hình 3.14. Khuẩn lạc chủng MR4 Hình 3.15. Bào tử chủng MR4
Hình 3.16. Khuẩn lạc chủng BR5 Hình 3.17. Cành bào tử của chủng BR5
Trong số 25 chủng nấm ký sinh trên rệp sáp cà phê đã phân lập, chúng tôi nhận thấy có 8 chủng với đặc điểm hình thái về khuẩn lạc, cành bào tử và bào tử khó giám định được đến loài, nên chúng tôi sử dụng công nghệ đọc trình tự DNA và so sánh với ngân hàng gene. Các chủng và mồi sử dụng trong nghiên cứu và kết quả nghiên cứu sau khi giải mã trình tự gene từng chủng, so sánh độ tương đồng với các trình tự tham chiếu được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả định tên các mẫu nấm ký sinh bằng phương pháp giải trình tự gene (giám định tại ĐH Missouri – USA, 2011)
TT Mẫu Trình tự Mồi Loài gần nhất Trình tự tham
chiếu Độ tương đồng