B mạn
Tất cả bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B vào khám tại Phịng khám Gan, được chẩn đốn xác định viêm gan B mạn. Chúng tôi tiến hành ghi nhận dấu hiệu lâm sàng ở bệnh nhân qua hỏi bệnh sử, tiền sử và thăm khám lâm sàng nhằm phát hiện triệu chứng, hội chứng của viêm gan B mạn, ghi nhận những đặc điểm của bệnh nhân viêm gan B mạn.
+ Sốt: được xác định khi nhiệt độ cơ thể lấy ở nách và được đo bằng nhiệt kế; chia thành ba mức độ sốt nhẹ (> 370 C đến 380 C), vừa (> 380 C đến 390 C), cao (> 390 C).
- Xét nghiệm định tính HBsAg huyết thanh
Xét nghiệm này được thực hiện bằng kỹ thuật ELISA dựa trên nguyên lý ‘bánh kẹp’ (sandwich), thực hiện trên máy ARCHITECT Plus C 4000, hãng sản xuất Mỹ, tại Bệnh viện Trường Đại học Y dược Cần Thơ.
+ Kit xét nghiệm: Architect HBsAg qualitative II Reagent kit (2G22) + Nguyên lý xét nghiệm: Xét nghiệm HBsAg dựa trên kỹ thuật ELISA, là một trong những bước xét nghiệm miễn dịch cho phát hiện chất lượng của HBsAg trong huyết thanh và huyết tương sử dụng CMIA công nghệ với các giao thức thử nghiệm linh hoạt, được gọi là Chemiflex. Mẫu, anti-HBs vi hạt thuận từ tráng, và anti-HBs acridinium nhãn liên hợp được kết hợp để tạo ra một hỗn hợp phản ứng. HBsAg hiện diện trong mẫu liên kết với các vi hạt tráng anti-HBs và các anti-HBs acridinium nhãn liên hợp. Sau khi rửa, phụ trợ rửa đệm được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Sau một chu kỳ, các giải pháp trước khi kích hoạt và kích hoạt được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Các kết quả phản ứng chemiluminescent được đo bằng đơn vị ánh sáng tương đối (RLUs). Một mối quan hệ trực tiếp nào tồn tại giữa số lượng HBsAg trong mẫu và RLUs phát hiện bởi hệ thống quang học. Sự hiện diện hay vắng mặt của HBsAg trong mẫu được xác định bởi so sánh các tín hiệu chemiluminescent trong phản ứng với các tín hiệu cắt xác định từ một đường chuẩn hoạt động. Nếu tín hiệu chemiluminescent trong các mẫu vật lớn hơn hoặc bằng tín hiệu cắt, mẫu được xem là phản ứng đối với HBsAg. Đọc kết quả với máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm.
+ Kết quả: dựa trên tỷ lệ của RLU mẫu để cắt RLU (S/Co). + Giá trị âm tính: < 1 S/Co. Giá trị dương tính: > 1 S/Co. - Xét nghiệm định tính HBeAg huyết thanh
Xét nghiệm này được thực hiện bằng kỹ thuật ELISA, Kit thử phát hiện kháng nguyên hòa tan gắn với kháng nguyên nhân virus Viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương, thực hiện trên máy ARCHITECT Phus C 4000, hãng sản xuất Mỹ, tại Bệnh viện Trường Đại học Y dược Cần Thơ.
+ Kit xét nghiệm: Architect HBeAg kit.
+ Nguyên lý xét nghiệm: Xét nghiệm HBeAg dựa trên kỹ thuật ELISA bằng phương pháp sandwich (kẹp vào giữa), các giếng nước được phủ bởi anti-HBe. Khi tiêm huyết thanh vào khay, các chứng chứa HBeAg sẽ tạo thành phức hợp miễn dịch. Sau khi ủ, mẫu huyết thanh thừa sẽ được loại bỏ vào các giếng được rửa sạch bằng đệm. Tiếp tục thêm cộng hợp anti HBe gắn peroxydase (HRP). Các kháng thể của cộng hợp sẽ gắn vào phức hợp nói trên (nếu có). Sau khi rửa sạch và ủ với các chất tetramethylbenidine (TMB), phản ứng hiện màu vàng khi dùng acide sulphoride để hãm phản ứng. Nồng độ chất màu tương ứng với sự hiện diện của HBeAg trong huyết thanh. Sự vắng mặt của HBeAg biểu hiện bằng sự không bắt màu hoặc là bắt màu yếu. Đọc kết quả với máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm.
+ Giá trị âm tính: < 1 S/Co. Giá trị dương tính: > 1 S/Co. - Xét nghiệm định tính Anti-HBe huyết thanh
Xét nghiệm này được thực hiện bằng kỹ thuật ELISA, Kit thử phát hiện sự có mặt của kháng thể kháng virus Viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương, thực hiên trên máy ARCHITECT Phus C 4000, hãng sản xuất Mỹ, tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.
+ Kít xét nghiệm: Architect anti-HBe kit.
+ Nguyên lý xét nghiệm: Xét nghiệm anti-HBe dựa trên nguyên tắc cạnh tranh vị trí gắn giữa anti-HBe trong mẫu bệnh phẩm và HBeAg được phủ trên thành giếng. Anti-HBe nếu hiện diện trong mẫu thử sẽ cạnh tranh với một lượng cố định kháng thể kháng thể với HBe được gắn kết với men
peroxidase (anti-HBe-HPR) để gắn kết với một số vị trí gắn giới hạn trên thành giếng đã được phủ gắn kháng nguyên HBeAg. Như vậy, tỷ lệ kháng thể kháng HBe được đánh dấu bằng men peroxidase gắn kết trên thành giếng sẽ tỷ lệ nghịch với nồng độ tập trung của anti-HBe trong mẫu thử. Sau giai đoạn ủ mẫu thử và kháng thể đối với HBe được đánh dấu bằng men peroxidase hồn tất, những men anti-HBe khơng gắn kết sẽ được lấy ra bằng cách rửa giếng. Tiếp theo, dung dịch cơ chất được nhỏ vào giếng. Sau khi ủ, một màu vàng sẽ hiện lên và cường độ của màu tỷ lệ nghịch với lượng anti-HBe trong mẫu thử đã gắn kết trên giếng. Giá trị hấp thu của các chứng và mẫu thử được xác định bằng cách sử dụng máy đọc ở bước sóng 450nm.
+ Giá trị dương tính: < 1 S/Co. Giá trị âm tính: > 1 S/Co. - Xét nghiệm định lượng nồng độ HBV-DNA trong máu
Định lượng HBV-DNA theo kỹ thuật Real time PCR. Xét nghiệm này được thực hiện tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ được tiến hành trên bộ kit HBV Real TM Quant Sacacc của Công ty Việt Huy, Hãng sản xuất là SACACE (Được sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001: 2008 và 13485: 2004), nước sản xuất là ITALY với hệ thống máy SACACE 300X5P. Real time PCR là một kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được. Thực hiện trên máy CFX 96 của ROCHE Diagnostic.
+ Nguyên lý xét nghiệm: Về nguyên tắc thì PCR/real-time PCR đạt được độ nhạy cao, tuy nhiên trên thực tế thì độ nhạy cịn tùy thuộc rất nhiều vào sự thiết kế hay chọn mồi, vào thiết bị luân nhiệt, vào hóa chất, đặc biệt là enzym Taq polymerase được sử dụng. Khâu khuếch đại sẽ rất khó đạt được độ nhạy và duy trì độ nhạy trong quá trình lưu trữ nếu nhà sản xuất hay người
làm thí nghiệm khơng chọn lọc Taq polymerase để sử dụng. Ngoài các yếu tố kỹ thuật cần phải quan tâm ở trên, để đảm bảo được độ nhạy của khâu khuếch đại, người làm thí nghiệm hay nhà sản xuất phải kiểm tra độ nhạy của các PCR mix trước khi đưa vào sử dụng. Phương pháp kiểm tra là thử nghiệm trên các độ pha lỗng của DNA đích đã biết trước số lượng copy trong một đơn vị thể tích. PCR mix được gọi là đạt độ nhạy khi đạt được giới hạn phát hiện (LOD) là một copy DNA đích cho vào PCR mix, nghĩa là trong thể tích mẫu cho vào PCR mix chỉ cần có một copy DNA đích là có thể cho kết quả khuếch đại thành nhiều bản sao có thể phát hiện được khi phân tích kết quả. Phương pháp cặp mồi (primer) được thiết kế trong vùng gen S của bộ gen HBV để nhân bản một trình tự mục tiêu có kích thước 88 cặp base. Số lượng bản sao HBV tạo ra trong quá trình PCR sẽ được ghi nhận chính xác ở từng thời điểm. Dựa vào đường cong chuẩn thiết lập với nồng độ HBV-DNA xác định có thể tính được số lượng bản sao HBV hiện diện trong mẫu ban đầu.
+ Ngưỡng phát hiện HBV: khi nồng độ đạt 2 x 102 copies/ml. + Có 2 giá trị:
Nếu nồng độ < 2 x 102 copies/ml: mẫu âm tính.
Nếu nồng độ ≥ 2 x 102 copies/ml: mẫu dương tính. Giá trị dương tính được chia thành các mức độ: < 2 x 104 ; ≥ 2 x 104 - < 2 x 106 ; 2 x 106 - 2 x 108 ; và > 2 x 108.
- Xét nghiệm công thức máu
Xét nghiệm được thực hiện trên máy CELLTAC E của hãng NIKOHDEN, Mode MEK - 7222k cho kết quả 22 thơng số, tại phịng huyết học, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.
+ Hồng cầu:
Nguyên lý xét nghiệm: Xét nghiệm được tiến hành trên máu toàn phần. Lấy mẫu bệnh phẩm máu vào ống xét nghiệm huyết học (ống chống đông
bằng EDTA) và lắc nhẹ ống nghiệm để trộn bệnh phẩm với chất chống đông chứa trong ống và được tiến hành trên hệ thống máy CELLTAC E.
Giá trị bình thường: 4,2 ± 0,21.
Nếu giá trị > 4.3 x106 /mm3 tăng và < 3.5 x106 /mm3 giảm. Các chỉ số hồng cầu:
Hemoglobin: Giá trị bình thường:14,6 ± 0,60.
Nếu giá trị > 14g/100ml là tăng và < 12g/100ml giảm. Hematocrit: Giá trị bình thường: 43 % ± 3.
Nếu giá trị > 43g/l là tăng và < 38g/L giảm.
+ Bạch cầu
Nguyên lý xét nghiệm: Mẫu được tiến hành trên máu tồn phần, bệnh nhân khơng cần phải nhịn ăn trước khi lấy máu làm xét nghiệm. Lấy mẫu bệnh phẩm máu vào ống xét nghiệm huyết học chống đông bằng EDTA và được thực hiện trên máy CELLTAC E.
Giá trị bình thường: 4.500-10500/mm3. Nếu giá trị < 4500/mm3 là giảm và > 10500/mm3 tăng.
+ Tiểu cầu
Chuẩn bị bệnh nhân: cho bệnh nhân nằm thoải mái trên giường, chọn tĩnh mạch thích hợp thường lấy máu ở nếp gấp khuỷu tay, Sát khuẩn da thật kỹ và để khô. Ðưa kim vào tĩnh mạch bơm từ từ máu theo thành ống.
Nguyên lý xét nghiệm: Mẫu được tiến hành trên máu toàn phần, bệnh nhân không cần phải nhịn ăn trước khi lấy máu làm xét nghiệm. Lấy mẫu bệnh phẩm máu vào ống xét nghiệm huyết học chống đông bằng EDTA và được thực hiện trên máy CELLTAC E.
Giá trị bình thường 150.000 – 400.000/mm3; Tăng > 450.000/ mm3 ; Giảm < 150.000/ mm3.
Đo hoạt độ men AST, ALT huyết thanh bằng kỹ thuật đo độ động học men trên máy ARCHITECT i 1000, thực hiện tại phịng xét nghiệm sinh hóa Bệnh viện Trường Đại học Y dược Cần Thơ.
+ Nguyên lý xét nghiệm AST: cho huyết thanh bệnh nhân tác dụng với cơ chất, định lượng Oxaloacetate tạo thành.
L-Aspartat + 2-Oxoglutarat ASAT L-Glutamat + Oxalacetat.
Oxalacetat + NADH + H+ L-Malat + NAD+
+ Nguyên lý xét nghiệm ALT: cho huyết thanh bệnh nhân tác dụng với cơ chất, định lượng Pyruvate tạo thành.
L-Aspartat + 2-Oxoglutarat ALAT L-Glutamat + Oxalacetat Oxalacetat + NADH + H+ L-Malat + NAD+
+ Thực hành và kết quả: Lấy 2ml máu tĩnh mạch gởi phịng xét nghiệm sinh hóa, và đo bằng máy ARCHITECT i 1000. Đơn vị biểu thị là UI / lít. So sánh với kết quả chuẩn (của máy ở nhiệt độ 37°C):
+ Giá trị bình thường: AST: 0-37 UI/L; ALT: 0-40 UI/L.
Men transaminase tăng cao do hủy hoại tế bào gan. Phân độ tăng men transaminase (nhân với giới hạn trên của giá trị bình thường).
Nhẹ: < 2 lần giới hạn trên bình thường. Vừa: 2-5 lần giới hạn trên bình thường. Nặng: > 5 lần giới hạn trên bình thường. - Siêu âm bụng tổng quát
Siêu âm bụng được thực hiện với hệ thống máy siêu âm NEMIO XG hãng TOSHIBA Nhật, tại phịng chẩn đốn hình ảnh Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.
- Tư thế bệnh nhân: nằm ngữa là tư thế thông thường nhất; riêng với khảo sát gan tư thế nghiêng trái sau và nghiêng trái rất cần thiết nhằm để gan
MDH
đổ ra phía trước và hạ thấp xuống dưới sườn tạo nên cửa sổ xuyên âm tốt khi đầu dò đặt dưới bờ sườn và bộc lộ phần trên của gan sát vịm hồnh.
- Phương tiện: sử dụng hai đầu dò với tần số 3.5 MHz, 5 MHz tùy theo mức độ gầy hay mập của bệnh nhân.
- Trong giai đoạn viêm gan mạn: viêm gan thể hoạt động có biểu hiện thay đổi về hình thái thường gặp hơn là trong viêm gan thể tồn tại. Kích thước gan bình thường hoặc nhỏ, bờ gan khơng cịn đều, đặc biệt cấu trúc nhu mơ thô dạng hạt, làm cho mẫu hồi âm của cấu trúc nhu gan không đồng nhất, khoảng cửa có biểu hiện dày và tăng âm. Khảo sát hình ảnh viêm gan mạn trên siêu âm: mặt cắt dưới sườn cho thấy khoảng quanh cửa dày và tăng hồi âm kèm cấu trúc gan thô và tăng hồi âm.