3.3.1 Các bước thí nghieơm
Bạng 3.3 Noơi dung và các bước thí nghieơm
Thứ tự Bước thí nghieơm Noơi dung tiên hành
1 GIÔNG Sưu taơp giông - Sàng lĩc giông cho từng lối nguyeđn lieơu và kieơu leđn men - Cại thieơn giông - Nhađn giông
2 NGUYEĐN LIEƠU Maơt rư đường - Nước mía - Dịch
trái cađy phê thại - Tinh boơt thụy phađn
3 KIEƠU LEĐN MEN Leđn men beă maịt - Leđn men chìm
4 CÁC ĐIEĂU KIEƠN LEĐN MEN
PHÒNG THÍ NGHIEƠM pH - Nhieơt đoơ - Thời gian - Tỷ leơ giông - Phương thức khuây đạo 5 LEĐN MEN QUY MOĐ PILOT Leđn men beă maịt quy mođ pilot tređn dieơn tích roơng 1,5m2 - Leđn men beă maịt quy mođ pilot tređn khay nhỏ- Leđn men chìm quy mođ pilot
6 SẠN PHAƠM BC Dáng màng - Miêng - Hát - Sợi – Boơt
7 ỨNG DÚNG
- Sử dúng BC làm chât neăn ( matrix) đeơ cô định tê bào vi khuaơn
- Sử dúng BC làm giá đỡ (supporter) đeơ leđn men bán raĩn thu sinh khôi vi sinh vaơt.
-Sử dúng tê bào vi khuaơn Acetobacter xylinum làm tác nhađn kêt dính.
3.3.2 Laơp boơ sưu taơp giông
Đeơ laơp boơ sưu taơp giông, chúng tođi tiên hành :
• Thu thaơp giông và mău từ các nguoăn trong và ngoài nước. Các mău được giới hán có sự hieơn dieơn cụa vi khuaơn Acetobacter.
• Sơ tuyeơn nhanh và đánh giá các chụng Acetobacter có khạ naíng sạn sinh cellulose tređn mođi trường dịch theơ.
• Với các dòng sơ tuyeơn, tiên hành kieơm tra các đaịc đieơm sinh hĩc ( hình thái hĩc, tê bào hĩc, sinh trưởng tređn mođi trường đaịc, lỏng, các đaịc đieơm sinh lý và sinh hóa ) [1,2].
Hình thái hĩc và tê bào hĩc: khạo sát các đaịc đieơm hình dáng tê bào, sự saĩp xêp cụa tê bào, khạ naíng di đoơng, sự toăn tái cụa bào tử, kích thước tê bào, nhuoơm Gram, bao nhaăy.
Hình ạnh vi theơ chúp tređn kính hieơn vi đieơn tử JEM 1010 (x10000) và kính hieơn vi đoơ phóng đái 1000 laăn.
Hình dáng và sự lieđn kêt cụa tê bào được xác định khi soi kính hieơn vi. Kích thước tê bào được xác định dưới kính hieơn vi nhờ traĩc vi thị kính. Phát hieơn khạ naíng di đoơng trong tieđu bạn giĩt treo có boơ sung HgCl2 0,1% đeơ phađn bieơt với chuyeơn đoơng Brown.
Phát hieơn bào tử khi nhuoơm màu phađn bieơt tê bào, bào tử và khi theo dõi sự phát trieơn trong mođi trường được cây baỉng huyeăn phù đã khử trùng Pasteur. Phát hieơn bao nhaăy baỉng cách dùng mực nho đeơ táo ra sự tương phạn ađm.
Đaịc đieơm sinh trưởng tređn mođi trường đaịc:
Phađn laơp và nuođi cây tređn mođi trường thách đĩa theo phương pháp Vinogradxki.
Khạo sát các đaịc đieơm khuaơn lác cụa các chụng vi khuaơn sơ tuyeơn thođng qua hình dáng, kích thước, đường kính, đaịc tính quang hĩc, màu saĩc khuaơn lác, beă maịt và maịt caĩt ngang khuaơn lác, mép khuaơn lác, câu trúc và đoơ đaịc khuaơn lác.
Đaịc đieơm sinh trưởng tređn mođi trường lỏng:
Khạo sát mức đoơ sinh trưởng, khạ naíng táo màng và đaịc đieơm cụa màng.
Đaịc đieơm sinh lý:
Đaịc đieơm sinh hóa:
Khạo sát các đaịc đieơm sinh hóa dùng đeơ phađn lối bao goăm oxy hóa ethanol thành acid acetic, catalase, sinh trưởng tređn mođi trường Hoyer, chuyeơn hóa glucose thành acid, chuyeơn hoá glycerol thành dihydroxyaceton, khạ naíng sinh saĩc tô nađu, khạ naíng toơng hợp cellulose.
. Khạ naíng oxy hóa ethanol:
Theđm 1ml dung dịch Bromocresol vào mođi trường kieơm tra. Trước khi cây vi khuaơn cho theđm 1ml ethanol 15% vào.
Đôi với Acetobacter xylinum, mođi trường chuyeơn thành màu vàng sau đó trở thành màu lam lúc.
. Sinh trưởng tređn mođi trường Hoyer.
Acetobacter xylinum khođng phát trieơn tređn mođi trường Hoyer. . Khạ naíng chuyeơn hoá glucose thành acid:
Quan sát sự xuât hieơn vòng sáng quanh khuaơn lác cụa Acetobacter xylinum
khi nuođi tređn mođi trường kieơm tra.
. Khạ naíng chuyeơn hóa glycerol thành dihydroxyaceton:
Nhỏ dung dịch Fehling leđn maịt thách đeơ kieơm tra sự táo thành dihydroxyaceton (có sự xuât hieơn vòng CuO quanh khuaơn lác táo thành màu đỏ).
. Sinh saĩc tô nađu:
Acetobacer xylinum khođng sinh saĩc tô nađu. . Sinh toơnghợp cellulose:
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% leđn maịt thách sẽ khođng xuât hieơn màu lam.
Lây 1ml H2O2 nhỏ trực tiêp vào ông thách nghieđng đã cây Acetobacter, sau 2 giờ nuođi cây nêu có bĩt khí xuât hieơn là catalase dương tính [1, 2, 38].
3.3.3 Sàng lĩc giông phù hợp với nguoăn nguyeđn lieơu
Sàng lĩc giông thích ứng với từng nguoăn nguyeđn lieơu (rư đường, nước mía,…) thođng qua các chư tieđu :
- Khạ naíng taíng trưởng tređn mođi trường đaịc (rư đường, nước mía,…)
- Maơt đoơ tê bào tređn mođi trường lỏng(rư đường, nước mía,…)
- Thời gian xuât hieơn màng
- Đoơ dày cụa màng
- Sạn lượng BC thu được trong leđn men beă maịt và leđn men chìm.
3.3.4 Cại thieơn giông: Đoơt biên baỉng tia UV, chĩn lĩc dòng đoơt biên kháng Sulfaguanidine, có khạ naíng toơng hợp cellulose cao Sulfaguanidine, có khạ naíng toơng hợp cellulose cao
Gađy đoơt biên baỉng tia UV ở bước sóng 260nm đeơ chĩn lĩc dòng có khạ naíng táo ra BC cao tređn mođi trường rư đường qua các khạo sát:
- Aûnh hưởng cụa tia tử ngối đên tê bào vi khuaơn Acetobacter xylinum, xác định mức đoơ sông sót và tỷ leơ % gađy chêt.
- Chĩn lĩc đoơt biên kháng Sulfaguanidine.
- Khạ naíng leđn men cellulose cụa các dòng đoơt biên tređn mođi trường rư đường, so sánh maơt đoơ tê bào và sạn lượng BC cụa các dòng đoơt biên so với dòng gôc.
• Tác đoơng gađy chêt cụa tia tử ngối leđn tê bào vi khuaơn
Acetobacter xylinum:
- Hốt hóa và nhađn giông vi khuaơn A.xylinum ở 28-300C trong 4 ngày. Xác định maơt đoơ tê bào trong dịch nhađn giông. Chuyeơn dịch nhađn giông vào đĩa Petri vođ trùng sao cho beă cao cụa dịch giông trong đĩa là 4mm.
- Chiêu xá tia tử ngối: Trong tụ cây vođ trùng được bô trí moơt đèn tử ngối có chieău dài 60 cm, máy khuây từ. Khoạng cách từ đèn tử ngối đên beă maịt máy khuây từ là 9cm. Đaịt đĩa Petri chứa dịch tê bào vi khuaơn
A.xylinum leđn máy khuây từ trong tụ vođ trùng ( đieău chưnh tôc đoơ khuây phù hợp đeơ tê bào được troơn đeău trong quá trình chiêu xá). Mở naĩp hoơp Petri và baơt đèn UV đeơ thực hieơn các lieău chiêu xá như sau : 0; 10-4J/cm2; 1,5.10-4J/cm2; 2.10-4J/cm2; 2,5.10-4J/cm2; 3.10-4J/cm2. Thời gian chiêu xá tương ứng là 0; 30; 60; 90; 120 và 150 giađy.
- Ở moêi lieău chiêu xá, dùng pipetman hút 500µl cho vào các ông eppendorf tương ứng.
- Đeơ tránh ánh sáng tiêp xúc với dịch, các ông eppendorf caăn bĩc giây bác beđn ngoài và ụ tôi trong 2 giờ đeơ tránh hieơn tượng quang phúc hoăi.
- Trại dịch giông tê bào chiêu xá leđn mođi trường chĩn lĩc đoơt biên kháng Sulfaguanidine.
- Xác định tỷ leơ sông sót cụa các tê bào sau chiêu xá.
• Chĩn lĩc các đoơt biên kháng Sulfaguanidine
- Với 4 lođ thí nghieơm A,B, C, D như sau:
Dịch giông Mođi trường
Dịch giông khođng chiêu xá
Dịch giông chiêu xá Mođi trường khođng có
Sulfaguanidine
Lođ A Lođ C
Mođi trường Sulfaguanidine 850 mg/l mođi trường
LođB Lođ D
Sau 4 ngày ụ ở nhieơt đoơ 28-300C, đêm sô khuaơn lác tređn moêi đĩa ở moêi lođ thí nghieơm.
Kieơm tra lái tính kháng Sulfaguanidine cụa các chụng đoơt biên baỉng phương pháp in dâu nhung.
3.3.5 Khạo sát quá trình nhađn giông quy mođ nhỏ và quy mođ pilot
Các khạo sát quá trình nhađn giông xác định:
- Xác định nguoăn[N] hữu cơ: Sử dúng 4 nguoăn pepton, cao nâm men, dịch đaơu nành và dịch chiêt nâm men thụy phađn. Xác định nguoăn [N] hữu cơ phù hợp.
- Xác định tôc đoơ laĩc : Khạo sát 5 tôc đoơ quay cụa máy laĩc 100, 200, 250, 300 và 350 vòng/ phút.
- Xác định thời gian nhađn giông trong khoạng từ 2 đên 6 ngày.
- Aûnh hưởng cụa nhieơt đoơ nuođi cây trong quá trình nhađn giông qua 5 mức 25oC, 28oC, 30oC, 32oC và 35oC.
- Xác định phương thức khuây đạo trong nhađn giông quy mođ lớn (nhađn giông câp 3) qua 3 kieơu: fermentor, thiêt bị có heơ thông thoơi khí và thiêt bị có heơ thông thoơi khí - hoăi lưu.
Fermentor: Bio Flo 115 Modular Fermentor ME1275 – 0055, với các thođng sô đã xác định ở tređn veă mođi trường nhađn giông, thời gian, nhieơt đoơ, pH tôi ưu, heơ thông cánh khuây chẽ ba với tôc đoơ 200 vòng / phút đát noăng đoơ oxy hòa tan trong khỏang 0,5-0,6 mmol / l / phút.
Thiêt bị có heơ thông thoơi khí: máy súc khí Lifetech AP1000 với các thođng sô như sau:
- Lưu lượng khí max: 1 m3/phút.
- Lưu lượng khí dùng trong thí nghieơm: 5.10-2 m3/phút. Thiêt bị có heơ thông thoơi khí – hoăi lưu:
+ Máy súc khí Lifetech AP1000 với các thođng sô như tređn. + Máy bơm Lifetech AP1600 với lưu lượng bơm 100 l/h. Chư tieđu theo dõi: maơt đoơ tê bào/ml.
Moơt sô phương thức trong quá trình nhađn giông, leđn men BC được ghi nhaơn qua hình 3.1.
1.Lín men bề mặt 2. Lín men chìm (Máy lắc)
3. Lín men chìm (Thoơi khí-Hồi lưu) 4. Lín men chìm (Fermentor)
Hình 3.1. Mođt sô phương thức trong quá trình nhađn giông, leđn men BC
3.3.6 Thành phaăn mođi trường phù hợp phương thức leđn men beă maịt và leđn men chìm
- Xác định nguoăn [N] hữu cơ: Sử dúng 4 nguoăn là pepton, cao nâm men, dịch đaơu nành và dịch chiêt nâm men thụy phađn.
- Xác định noăng đoơ [N] hữu cơ ( dịch chiêt nâm men): Với 5 mức [N] thay đoơi 1% , 3%, 5%, 7%, 9%.
Các chư tieđu theo dõi: maơt đoơ tê bào, sạn lượng S-BC, sạn lượng A-BC.
3.3.7 Moơt sô đieău kieơn nuođi cây ạnh hưởng đên quá trình leđn men beă maịt và leđn men chìm BC
- Aûnh hưởng cụa pH ban đaău với các mức khạo sát pH thay đoơi từ 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6.
- Aûnh hưởng cụa lượng giông và thời gian leđn men với 5 mức thay đoơi tỷ leơ giông 4%, 6%, 8%, 10%, 12% trong thời gian theo dõi từ 4 -8 ngày.
- Aûnh hưởng cụa nhieơt đoơ mođi trường trong quá trình leđn men BC với 5 mức 26oC , 28 oC, 30 oC, 32oC, 34oC.
- Rieđng đôi với kieơu leđn men chìm đeơ thu A-BC : Theo dõi tôc đoơ quay cụa máy laĩc trong leđn men chìm và theo 3 phương thức khuây đạo: sử dúng máy laĩc, thiêt bị có heơ thông thoơi khí và thiêt bị có heơ thông thoơi khí - hoăi lưu.
Các chư tieđu theo dõi: Sạn lượng S-BC, sạn lượng A-BC.
3.3.8 Nghieđn cứu biên đoơng trong quá trình leđn men BC ở quy mođ phòng thí nghieơm nghieơm
Với các thođng sô tôi ưu, khạo sát các biên đoơng trong quá trình leđn men beă maịt và leđn men chìm cellulose vi khuaơn ở quy mođ phòng thí nghieơm với 4 chư tieđu:
- Maơt đoơ tê bào (106 tê bào/ ml).
- Đường toơng (g/ l).
- pH.
- Sạn lượng S-BC hoaịc A-BC ( g/ l mođi trường).
Maơt đoơ tê bào đêm gián tiêp khuaơn lác tređn mođi trường thách đĩa. Các phương pháp phađn tích đường Bectrand, so màu, đo pH baỉng máy đo pH. S-BC hoaịc A-BC sau khi thu hốch đeơ ráo nước hoàn toàn, cađn trĩng lượng tươi đeơ xác định sạn lượng BC tươi.
S-BC hoaịc A-BC sau khi thu hốch đeơ ráo nước hoàn toàn, sây ở 1050C cho đên khi khođng thay đoơi trĩng lượng, cađn trĩng lượng khođ đeơ xác định sạn lượng BC khođ.
3.3.9 Thử nghieơm leđn men BC ở quy mođ pilot
3.3.9.1 Leđn men beă maịt tređn dieơn tích roơng 1,5 m2
- Thí nghieơm tređn các khung goê có dieơn tích 1,5 m2 (1m x 1,5 m), lót baỉng bao PE mới lối 2 lớp có thanh trùng (ngađm coăn) chứa 20 lít dịch mođi trường leđn men. Quy mođ 100 lít/mẹ, thí nghieơm laơp lái 3 laăn.
- So sánh biên đoơng trong quá trình leđn men beă maịt BC tređn mođi trường rư đường quy mođ phòng thí nghieơm và quy mođ pilot với các chư tieđu biên đoơng tương tự múc 3.3.8.
- Chư tieđu theo dõi: Maơt đoơ tê bào, Đường toơng, pH, sạn lượng S-BC. 3.3.9.2 Leđn men beă maịt quy mođ pilot tređn nhieău khay nhỏ
- Kích thước khay 30 cm x 25 cm chứa 1 lít mođi trường (MT) leđn men.
- Quy mođ: 200 lít/mẹ.
- Chư tieđu theo dõi : Sạn lượng S-BC.
3.3.9.3 Leđn men chìm quy mođ pilot với thiêt bị leđn men có heơ thông thoơi khí - hoăi lưu.
- Dung tích bình chứa: 25 lít.
- Theơ tích dịch leđn men: 15 lít / bình.
- Quy mođ: 75 lít/ mẹ.
So sánh biên đoơng quá trình leđn men chìm BC tređn mođi trường rư đường quy mođ phòng thí nghieơm và quy mođ pilot, đeơ cại thieơn sạn lượng A-BC qua các phương án đieău chưnh taíng tỷ leơ giông và kéo dài thời gian leđn men.
3.3.10 Phương pháp xử lý BC
- Múc đích: xử lý BC ( S-BC và A-BC) đeơ sử dúng BC làm chât neăn– giá theơ( matrix) cô định tê bào vi sinh vaơt.
- Yeđu caău: BC tươi thu được sau leđn men có đoơ ngaơm nước khá cao. Trong BC chứa moơt lượng lớn mođi trường leđn men và các sạn phaơm cụa quá trình trao đoơi chât (acid acetic …), do đó xử lý BC phại đát các yeđu caău sau:
• Có tính chât cơ lý beăn vững, oơn định đeơ chịu được các tác đoơng cụa mođi trường như khuây troơn, các áp lực …
• Vođ trùng.
• Lối bỏ hoàn toàn các táp chât đeơ chât neăn BC khođng ạnh hưởng đên tê bào vi sinh vaơt sẽ cô định.
- Phương pháp 1: Đun BC với NaOH 3% trong 30 phút. Trung hòa baỉng HCl 5%.
- Phương pháp 2: Ngađm với NaOH 3% trong 12 giờ. Trung hòa baỉng HCl 5%.
- Phương pháp 3: BC thođ thu được sau leđn men có aơm đoơ từ 90-92%.
• Ngađm nước: thời gian 24 h, thay nước 4 laăn.
• Vaĩt laăn 1: Thời gian 10 phút, tôc đoơ vaĩt 100-200 v/phút, aơm đoơ 50 -55% sau khi vaĩt.
• Ngađm nước cho trương nở trở lái: thời gian là 24h, thay nước 4 laăn.
• Vaĩt laăn 2: thời gian 10 phút, tôc đoơ vaĩt từ 100-200 v/phút, aơm đoơ sau khi vaĩt 50-55%.
• Sây: nhieơt đoơ sây là 40oC, thời gian là 10h và aơm đoơ sau khi sây là 12-15%.
Sau khi sây, với S-BC có theơ đeơ nguyeđn màng hoaịc caĩt thành các miêng nhỏ có kích thước 4 x 2 cm và 2 x 2 cm đeơ tieơn sử dúng (nêu caăn) , đôi với dáng A-BC thì đeơ nguyeđn dáng hát.
• Khử trùng: 121oC trong 15-20 phút.
- Phương pháp 4: Ngađm với NaOH 3% trong 2 giờ. Trung hòa baỉng HCl 5%. Laịp lái phương pháp 3.
- Xác định phương pháp xử lý BC phù hợp.
3.3.11 Phương pháp cô định vi khuaơn A.xylinum tređn BC
Bước 1) Xử lý dịch giông vi khuaơn caăn cô định
- Chuaơn bị giông thuaăn khiêt tređn mođi trường thách nghieđng.
- Nhađn giông : các chê đoơ nhađn giông tôi ưu múc 3.3.5. Maơt đoơđ giông trung bình đát 48.106 đên 5.107 tê bào/ml.
- Ly tađm thu sinh khôi giông
Bước 2) Phương pháp băy hâp thú vi khuaơn tređn BC: goăm 2 giai đốn
* Giai đốn 1: BC đóng vai trò là chât neăn ( matrix) đeơ hâp thú vi khuaơn caăn cô định.