Cũng với múc đích thu S-BC chúng tođi tiên hành leđn men beă maịt quy mođ 200 lít / mẹ nhưng tređn các khay nhựa có dieơn tích 30 cm x 25 cm được xêp xen kẹ choăng leđn nhau. Các khay được đaơy baỉng giây báo vođ trùng và được xêp trong phòng sách, thođng thoáng.
Sạn lượng BC thu được qua 3 mẹ leđn men , moêi mẹ 200 lít, thời gian leđn men 7 ngày như sau:
- Mẹ 1: 188kg S-BC/ 200 lít mođi trường, đát trung bình 940 g/ l mođi trường.
- Mẹ 2: 185kg S-BC/ 200 lít mođi trường, đát trung bình 925 g/ l mođi trường.
- Mẹ 3: 183,5kg S-BC/ 200 lít mođi trường, đát trung bình 918 g/ l mođi trường.
- Trung bình 3 mẹ leđn men: đát 928 g S -BC / l mođi trường.
Kêt quạ leđn men S-BC quy mođ pilot tređn khay nhỏ đát 96% so với quy mođ phòng thí nghieơm, tương đương 6,5g/ l/ h.
Nhaỉm múc đích thu nhaơn S-BC đeơ ứng dúng ở quy mođ pilot, ngối trừ moơt vài ứng dúng đaịc bieơt caăn dieơn tích BC lớn, phương thức leđn men pilot tređn khay nhỏ cho hieơu quạ cao và deê dàng thực hieơn. Các khay deê dàng khử trùng và nêu nhieêm khay nào thì lối bỏ khay đó. Từ thực nghieơm cho thây, giữa các mẹ leđn men chư caăn thanh trùng dúng cú leđn men và phòng leđn men thoáng sách.Trung bình khoạng sau 4 -5 mẹ leđn men caăn khử trùng phòng leđn men và các thiêt bị sử dúng.
4.4.3 Leđn men chìm quy mođ 75 lít / mẹ với phương thức thoơi khí-hoăi lưu.
Trong phaăn này, chúng tođi cũng tiên hành khạo sát các biên đoơng trong quá trình leđn men chìm quy mođ pilot, nhaỉm giại thích cho kêt quạ sạn lượng A-BC thu được. So sánh với quy mođ 1 lít :
- Mức đoơ gia taíng maơt đoơ tê bào ở quy mođ 75 lít giạm hơn. Cú theơ như sau: maơt đoơ tê bào oơn định và đát cao nhât vào ngày thứ 5 - 6 (khoạng 5.107
tê bào/ ml). Đưnh cụa đường bieơu dieên này văn thâp hơn đường bieơu dieên ở quy mođ nhỏ và thời gian chaơm hơn 1 ngày.
- Do ạnh hưởng cụa maơt đoơ tê bào, neđn hai chư tieđu đường toơng và pH cũng có sự khác bieơt so với quy mođ nhỏ. Tuy nhieđn nhìn chung xu hướng giạm daăn trong các ngày leđn men tương tự như ở quy mođ nhỏ.
- Sạn lượng A-BC giạm chư còn 800 g/ l mođi trường sau 8 ngày leđn men. Như vaơy sạn lượng A-BC trong quy mođ 75 lít chư đát 95% so với quy mođ 1 lít mà thời gian leđn men kéo dài theđm 1 ngày.
Maơt đoơ tê bào
10 20 30 40 50 60 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngày Tr ie ơu t ê bào/ m l pH 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngày pH Đường toơng 0 5 10 15 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngày g/l Sạn lượng A-BC 0 200 400 600 800 1000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngày g/l mođi trường
Đoă thị 4.13. So sánh các biên đoơng trong quá trình leđn men chìm cellulose vi khuaơn tređn mođi trường rư đường ở phòng thí nghieơm và quy mođ pilot.
(a) Phòng thí nghieơm. (b) Quy mođ pilot.
Xét dieên biên quá trình leđn men có nhaơn xét và đeă xuât như sau: Do maơt đoơ tê bào sút giạm so với quy mođ nhỏ, dăn đên quá trình sinh toơng hợp cellulose vi khuaơn cũng giạm theo. Đeă xuât taíng tỷ leơ giông ban đaău và kéo dài thời gian leđn men, cú theơ với các phương án đieău chưnh A, B, C, D ( bạng 4.17).
Sạn lượng A-BC thu được từ nuođi cây chìm qua các phương án đieău chưnh theơ hieơn qua đoă thị 4.14.
Bạng 4.17. Các phương án đieău chưnh đeơ cại thieơn sạn lượng A-BC ở quy mođ pilot.
Tỷ leơ giông
Thời gian leđn men 12% 15%
8 ngày A B 9 ngày C D 700 750 800 850 900 A B C D ĐC1 ĐC2 Sạn lượng A-BC (g/l )
A, B, C, D : Quy mođ pilot với các phương án đieău chưnh. ĐC1: Quy mođ pilot khođng đieău chưnh. ĐC2: Phòng thí nghieơm (1lít).
Đoă thị 4.14 Các phương án cại thieơn sạn lượng A-BC ở quy mođ pilot. Kêt quạ thực nghieơm cho thây, cạ 4 phương án đieău chưnh đeău taíng sạn lượng A-BC từ 800 g/ lít leđn 838±2g/ lít. Nêu taíng tỷ leơ giông leđn 12% thì thời gian leđn men phại kéo dài 9 ngày hoaịc taíng tỷ leơ giông leđn 15% thì thời gian leđn men 8 ngày, cho kêt quạ sạn lượng A-BC tương đương ở phòng thí nghieơm (khoạng 840g/ l mođi trường). Do kéo dài thời gian hơn quy mođ phòng thí nghieơm, neđn naíng suât leđn men chìm cellulose quy mođ pilot đát từ 3,9 g/ l/ h - 4,37g/ l/ h.
So với dữ lieơu trong các paten [112-120], sạn lượng S-BC trong leđn men beă maịt quy mođ pilot tređn khay nhỏ là hoàn toàn tương đương, sạn lượng A-BC trong leđn men chìm quy mođ pilot đát khỏang 80-85%. Kieơu leđn men beă maịt tređn dieơn tích roơng chưa tìm thây cođng bô.
4.5 Xử lý BC và sạn phaơm BC
Các tê bào vi khuaơn Acetobacter xylium phađn bô khaĩp heơ thông dại cellulose. BC táo thành bao quanh và bám chaịt tê bào vi khuaơn neđn phại tinh sách nhaỉm lối bỏ các tê bào vi khuaơn này. Ngoài ra, thành phaăn mođi trường dinh dưỡng và các chât trao đoơi trong quá trình leđn men được lưu giữ trong heơ thông máng lưới cellulose. Các phương pháp xử lý BC nhaỉm lối bỏ các táp chât và vi khuaơn đeơ BC trở thành giá theơ sách và trơ. Với 4 phương pháp xử lý, moêi phương pháp đeău có những ưu và nhược đieơm rieđng. Tât cạ các phương pháp đeău cho các thođng sô veă đoơ hút nước, đoơ chịu lực, đoơ chịu kéo khá cao và khođng có khác bieơt so với moơt sô cođng bô [89,102].Thođng qua tính chât cạm quan và đaịc tính câu trúc màng BC sau xử lý, phương pháp thứ 4 có ưu thê hơn, cạ veă thời gian và hieơu quạ. Phương pháp thứ 4 được chúng tođi chĩn đeơ xử lý BC (bạng 4.18).
Bạng 4.18 Moơt sô phương pháp tinh sách màng BC.
Moơt sô đaịc tính câu trúc BC STT Phương pháp xử lý BC Tính chât cạm quan Đoơ hút nước (g nước /g cellulose) Đoơ chịu lực (kg/cm2) Đoơ kéo đứt (kg/cm2) 1 Đun với NaOH 3%
(30 phút)- Trung hòa baỉng HCl 5%
Màu vàng saơm, chuyeơn qua màu vàng ngà, khođng mùi.
40 780 4,5
2 Ngađm với NaOH 3% (12 giờ)- Trung hòa baỉng HCl 5%
Màu vàng nhát, chuyeơn qua màu traĩng ngà, khođng mùi. 45 820 4,8 3 Ngađm nước (24 giờ)- Vaĩt (200 vòng/phút)- Laịp lái 2 laăn
Màu traĩng trong, khođng mùi, màng có tráng thái nhũn nhé.
48 800 4,2
4 Ngađm với NaOH 3% ( 2giờ)- Trung hòa baỉng HCl 5%- Vaĩt- Ngađm nước ( 2giờ)- Vaĩt.
Màu traĩng trong, khođng mùi, màng có tráng thái cứng như ban đaău.
Nhaỉm đa dáng các sạn phaơm BC phù hợp hướng ứng dúng, chúng tođi táo 4 dáng sạn phaơm BC như sau( bạng 4.19, hình 4.6):
Bạng 4.19 Đaịc tính sạn phaơm BC. S T T Sạn phaơm BC (Kích thước) Đoơ hút nước Cellulose (%) Tro (%) Hình 4.6 Hình ạnh sạn phaơm BC 1 Màng S-BC (20cmx25cm) 45 68 0,05 2 Miêng nhỏ S-BC (5mm x3-5mm) 36 68 0,05 3 Hát nhỏ A-BC (1-1,5 mm) 120 61 0,04 4 Boơt, Sợi A-BC (4-5mm) 115 61 0,04
- BC dáng màng: Màng S-BC sau xử lý, sây (aơm đoơ từ 10-15%), khử trùng 1210C - 20 phút.
- BC dáng miêng nhỏ: Màng S-BC caĩt thành miêng nhỏ kích thước 2x2cm, sau xử lý, sây (aơm đoơ từ 10-15%), khử trùng 1210C - 20 phút.
- BC dáng hát nhỏ: Hát A-BC sau xử lý, sây (aơm đoơ từ 10-15%), khử trùng 1210C - 20 phút.
- BC dáng sợi, boơt: Sợi A-BC sau xử lý, sây phun. Quá trình sây phun thực hieơn tređn máy Mini Spray Dryer – Yamoto với các thođng sô phù hợp qua thaím dò ( Lưu lượng dịch phun: 2 cm3/s, áp suât phun: 2 kg/cm2, nhieơt đoơ vào: 1500C, nhieơt đoơ ra: 800C ).
4.6 ỨÙng dúng mới cụa BC: Dùng BC làm chât neăn ( matrix) và giá đỡ ( supporter) đeơ cô định tê bào vi khuaơn.
4.6.1 BC phù hợp với các yeđu caău cơ bạn cụa chât neăn ( matrix) trong kỹ thuaơt cô định tê bào vi sinh vaơt
- Phù hợp hình dáng thiêt bị phạn ứng sinh hĩc: Hình dáng, kích thước cụa sạn phaơm BC rât đa dáng (hình 4.6) và có theơ chụ đoơng táo ra kích thước mong muôn (đôi với S-BC). Đađy là ưu đieơm cụa BC so với các chât neăn khác.
- BC có tính chât cơ lý beăn và oơn định : Đoơ chịu lực cụa BC khá cao, gaăn baỉng với đoơ chịu lực cụa nhođm [14,15,35]. Tính chât cơ lý beăn và oơn định cụa BC giúp cho chât neăn chịu được sự tác đoơng cụa mođi trường như khuây troơn hoaịc các áp lực ( bạng 4.18).
- BC khođng tan trong mođi trường phạn ứng .
- Chât neăn BC có đoơ trương nở tôt: Đoơ trương nở cao giúp cho sự khuêch tán cụa cơ chât, sạn phaơm . Mođi trường trong và ngoài chât neăn khođng có sự khác bieơt giúp cho vi sinh vaơt cô định giữ nguyeđn các đaịc đieơm sinh hĩc cụa tê bào tự do (bạng 4.18).
- BC đã qua xử lý khođng gađy tác đoơng kìm hãm đên hốt đoơng sông cụa vi sinh vaơt cô định. Sau giai đốn xử lý, BC chư là giá theơ trơ veă maịt hóa hĩc, có đoơ trương nở tôt (bạng 4.18) do đó khođng gađy tác đoơng kìm hãm đên hốt đoơng sông cụa vi sinh vaơt cô định. Đieău này cũng được khẳng định theđm bởi nhóm tác giạ Lương Thị Mỹ Ngađn và coơng sự veă sử dúng BC làm giá theơ nuođi cây mođ thực vaơt [6].
- Giá thành BC thâp: So với các vaơt lieơu khác, giá thành BC hứa hén thâp hơn rât nhieău.
- Chât neăn BC có khạ naíng tái sử dúng. - Chât neăn BC an tòan cho mođi trường sông.
Nhược đieơm cụa BC : Khođng theơ cô định những vi sinh vaơt sạn sinh ra cellulase vì bạn chât chât neăn là cellulose.
4.6.2 Thaím dò phương pháp cô định vi khuaơn leđn chât neăn (matrix) BC
Nhờ vào tính dẹo dai và tính hút nước, các lớp BC giúp tê bào vi khuaơn kháng lái được những thay đoơi khođng thuaơn lợi trong mođi trường sông. Câu trúc đaịc bieơt cụa BC [15,98,102] đã táo tieăn đeă cho những bước thaím dò tìm hieơu khạ naíng sử dúng BC làm chât neăn đeơ cô định tê bào vi sinh vaơt.
4.6.2.1 Phương pháp hâp thú :
Baỉng phương pháp hâp thú vi khuaơn ( 100 gam BC đã xử lý hâp thú trương nở hòan toàn 0,5 lít dịch giông có maơt đoơ giông 3.108 tê bào/ ml) chúng tođi thu được các kêt quạ như sau:
- Maơt đoơ vi khuaơn hâp thú vào 100 gam BC đã xử lý là 1,09.1011 tê bào, tức là 1,09.109 tê bào/ g chât neăn. Tỷ leơ vi khuaơn hâp thú cô định đát 73%.
- Maơt đoơ vi khuaơn hâp thú maịt ngoài chât neăn là 8,5.102 tê bào/ cm2.
- Maơt đoơ vi khuaơn hâp thú beđn trong chât neăn là 15tê bào/ cm2.
Như vaơy, maơt đoơ vi khuaơn hâp thú tređn beă maịt chât neăn BC cao hơn rât nhieău
( 57 laăn) so với hâp thú trong lòng chât neăn. Những lieđn kêt yêu giúp vi khuaơn hâp thú tređn beă maịt chât neăn khođng beăn vững [121-126], do đó deê dăn đên hieơn tượng rửa trođi tê bào cô định trong quá trình leđn men tái sử dúng.
4.6.2.2 Phương pháp băy - hâp thú:
Hai giai đốn:
- Aùp dúng phương pháp hâp thú, dùng BC là chât neăn đeơ cô định tê bào vi khuaơn (múc 4.6.2.1).
- Sau quá trình hâp thú, chât neăn BC được trương nở bởi dịch mođi trường tươi và giông vi khuaơn. Chât neăn BC lúc này đóng vai trò là giá đỡ (supporter) nuođi cây vi khuaơn. Chúng tođi táo đieău kieơn thích hợp đeơ vi khuaơn phát trieơn tređn giá đỡ này. Như vaơy sau thời gian ụ, maơt đoơ vi khuaơn gia taíng trong máng lưới cellulose và vi khuaơn cô định trong BC
lúc này bao goăm : sô vi khuaơn hâp thú ban đaău tređn chât neăn BC và sinh khôi vi khuaơn hình thành sau giai đĩan ụ.
Sau thời gian ụ 3 ngày, tiên hành quét vi khuaơn maịt ngoài và beđn trong chât neăn, kêt quạ thu được như sau:
- Maơt đoơ vi khuaơn maịt ngoài chât neăn là: 5,25.103 tê bào/ cm2.
- Maơt đoơ vi khuaơn beđn trong chât neăn là: 1,84.103 tê bào/ cm2.
Maơt đoơ vi khuaơn maịt ngoài chư cao hơn beđn trong chât neăn khỏang 2,9 laăn ( so với phương pháp hâp thú tỷ leơ này là 57 laăn). Như vaơy phương pháp này khaĩc phúc được nhược đieơm cụa phương pháp hâp thú, nhôt được moơt lượng lớn vi khuaơn trong lòng chât neăn BC.
- Maơt đoơ vi khuaơn trung bình trong 1 gam chât neăn được xác định là 2,865.109 tê bào/ g ( cao hơn phương pháp hâp thú 2,6 laăn).
Các kêt quạ tređn đã giại thích quá trình băy- hâp thú tê bào vi khuaơn vào
chât neăn BC như sau:
* Giai đốn 1: BC đóng vai trò là chât neăn ( matrix) đeơ hâp thú vi khuaơn caăn cô định.
Sau khi ngađm BC (đã xử lý thích hợp đeơ cô định) trong dịch giông vi khuaơn, BC sẽ trương nở. Vi khuaơn theo dịch trong quá trình trương nở sẽ bám vào xung quanh maịt ngoài và cạ len lỏi vào beđn trong máng cellulose.
* Giai đốn 2: BC đóng vai trò là giá đỡ ( supporter) đeơ nhađn giông thu sinh khôi vi khuaơn.
Trong thời gian tiêp túc nuođi cây với các đieău kieơn thích hợp đaịc đieơm sinh lý cụa A.xylinum (nhieơt đoơ từ 28-320C, đieău kieơn hiêu khí), maơt đoơ vi khuaơn tređn chât neăn- giá đỡ BC gia taíng.
Các nghieđn cứu veă câu trúc BC từ A.xylinum qua hình 4.7 góp phaăn cụng cô theđm cho các bieơn luaơn tređn đađy [58,98,102].
Hình 4.7 Tê bào vi khuaơn A.xylinum trong máng lưới cellulose [98]. Trong phám vi cụa đeă tài, chúng tođi tiên hành khạo sát tređn 2 đôi tượng nhaỉm chứng minh khạ naíng dùng BC là chât neăn trong cô định tê bào vi khuaơn:
• Cô định tê bào vi khuaơn Acetobacter xylinum tređn chât neăn BC táo chê phaơm đeơ ứng dúng trong leđn men cellulose vi khuaơn.
• Cô định vi khuaơn Lactic trong leđn men sữa chua.
4.6.3 Cô định vi khuaơn Acetobacter xylinum tređn chât neăn – giá đỡ BC táo chê phaơm đeơ ứng dúng trong leđn men cellulose vi khuaơn.
4.6.3.1 Maơt đoơ vi khuaơn phát trieơn tređn BC trong thời gian ụ.
Sau khi tiên hành ụ vi khuaơn tređn BC, tiên hành lây mău ở moêi thời gian ụ, theo dõi tôc đoơ phát trieơn.
Do câu trúc máng lưới S-BC và A-BC khác nhau [ 58, 95, 99], dăn đên đoơ ngaơm nước và đoơ trương nở khác nhau [58], do đó chúng tođi theo dõi maơt đoơ vi khuaơn phát trieơn tređn hai chât neăn S-BC và A-BC.
Từ đoă thị 4.15 và bạng 4.20, đôi với S-BC: ngày thứ nhât, sô lượng tê bào đát được là 1,444x109 tê bào/ g, trong 4 ngày đaău sô lượng tê bào taíng leđn với
tôc đoơ nhanh, và đát tráng thái oơn định ≈ 3,2x109 tê bào/ g sau ngày thứ 4. Ngày thứ 5 đát maơt đoơ tôi đa 3,28x109 tê bào/ g chât neăn.
Bạng 4.20 Maơt đoơ vi khuaơn Acetobacter xylinum BC16 theo thời gian ụ tređn chât neăn S-BC và A-BC (109 tê bào/ gam chê phaơm).
Chât neăn dáng S-BC Chât neăn dáng A-BC Thời
gian
(ngày) Laăn 1 Laăn 2 Laăn 3 Trung bình Laăn 1 Laăn 2 Laăn 3 Trung bình 1 1,462 1,455 1,415 1,444 2,068 2,115 2,110 2,098 2 1,896 1,910 1,887 1,898 2,925 2,906 2,937 2,923 3 2,527 2,522 2,514 2,521 3,512 3,521 3,525 3,519