(Số liệu được trích từ bảng 5.11 và 5.12 phần phụ lục)
Nhận xét: Từ kết quả của bảng 3.14 nhận thấy: hàm lượng protein trung
bình của chế phẩm protease từ ruột non thu được khi tủa bằng cồn là 163,64 mg/gCPE, tủa bằng muối là 291,11 mg/gCPE.
3.3.4 Hoạt độ riêng của chế phẩm protease từ ruột non
Tiến hành xác định theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.6 Kết quả trình bày trong bảng 3.15 và biểu đồ 3.4
Bảng 3.15: Hoạt độ riêng của chế phẩm protease từ ruột non
Tác nhân tủa Cồn 960 Muối (NH4)2SO4
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 1 2 3
Hoạt độ (UI/g CPE) 1,65 1,77 2,20 4,28 4,77 4,03
Lượng protein mg/g CPE 160,00 166,07 164,85 288,49 301,21 283,64 HđR (UI/mg protein) 0,010 0,011 0,013 0,015 0,016 0,014 HđR trung bình (UI/mg
protein) 0,011 0,015
Tác nhân tủa Cồn 960 Muối (NH4)2SO4
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 1 2 3
Trung bình Δ OD 0,044 0,046 0,045 0,159 0,166 0,156
Lượng protein
ứng với Δ OD (μ/ml) 40,00 41,52 41,21 144,24 150,61 141,82
Lượng protein mg /g CPE 160,00 166,07 164,85 288,49 301,21 283,64
Biểu đồ 3.4: Hoạt độ riêng của chế phẩm protease từ ruột non thu được khi tủa với các tác nhân khác nhau (UI/mg protein)
Nhận xét: từ bảng 3.15 và biểu đồ 3.4 nhận thấy: hoạt độ riêng trung bình
của chế phẩm protease thu nhận từ ruột non khi tủa bằng muối (NH4)2SO4 là 0,015 UI/mg protein cao hơn khi tủa bằng cồn là 0,011 UI/mg protein.
So với hoạt độ riêng của các CPE pepsin, pancreatin thì hoạt độ riêng của enzym ruột non là khá thấp, cĩ thể hàm lượng enzym ruột non tập trung ở dịch ruột, cịn ở màng nhầy thì lượng enzym khơng cao sau khi động vật bị giết mổ cũng cĩ ảnh hưởng đến hoạt độ enzym.
3.4 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYM THU NHẬN ĐƯỢC TRONG THỦY PHÂN MỘT SỐ PROTEIN
Chúng tơi xác định khả năng thủy phân của các chế phẩm enzym protease qua tỷ lệ N-formol/N-tổng (NF/NT%), nếu tỷ lệ này tăng cao thì khả năng thủy phân sẽ tăng theo tỷ lệ thuận.
Vì các chế phẩm enzym thu được khi tủa bằng muối (NH4)2SO4 cĩ hoạt độ riêng cao hơn khi tủa bằng cồn, nên chế phẩm enzym thu được cĩ độ tinh sạch hơn
Cồn 960 Muối (NH4)2SO4
Các tác nhân tủa khác nhau
HđR cu
ûa CP protease từ ruột
vì vậy chúng tơi chọn các chế phẩm enzym thu được khi tủa bằng muối (NH4)2SO4 để tiếp tục cho các nghiên cứu sau.
Để tính hiệu suất thủy phân (NF/NT) chúng tơi tiến hành xác định NT của các cơ chất đem thủy phân và giá trị NF trước và sau thủy phân.
Cơng thức tính:
Hiệu suất thủy phân:
Lượng Δ NF tạo thành:
Δ NF = NF sau thời gian thủy phân (t) - NF ban đầu (t=0)
3.4.1 Xác định N–tổng(NT) của các cơ chất thủy phân theo phương pháp Kjeldahl
Tiến hành theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.8. Kết quả trình bày trong bảng 3.16
Bảng 3.16: Hàm lượng NT của các cơ chất thủy phân
Mẫu cơ chất Casein 2% Cá thát lát 2%
Thể tích dịch cơ chất vơ cơ hĩa (ml) 3 3 Số lần thí nghiệm 1 2 3 1 2 3 V H2SO4 0,1N (ml) 2,40 2,16 2,10 0,84 0,70 0,74 NT (mg/ml) 8,52 7,67 7,46 2,98 2,49 2,63 Trung bình NT (mg/ml) 7,88 2,70
3.4.2 Khảo sát sự biến đổi tỷ lệ NF/NT theo thời gian thủy phân các cơ chất protein bởi chế phẩm pepsin
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.10. NF/NT = ΔNF
NT
3.4.2.1 Thủy phân casein
Kết quả hiệu suất thủy phân trình bày trong bảng 3.17
Bảng 3.17: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân casein theo thời gian bởi CP- pepsin
Cơ chất thủy phân Casein 2%
Thời gian thủy phân (giờ) ΔV NaOH 0,1N (ml) ΔNFtạo
thành (g/l) thủy phân (%)Hiệu suất
0 0,00 0,00 0,00 1 1,38 0,19 2,41 2 3,89 0,54 6,89 3 6,05 0,84 10,70 4 9,11 1,27 16,07 5 10,20 1,42 18,02 6 11,05 1,54 19,50 7 11,15 1,55 19,71 (Số liệu được trích từ bảng 5.13 phần phụ lục) 3.4.2.2 Thủy phân cá thát lát
Kết quả hiệu suất thủy phân trình bày trong bảng 3.18
Bảng 3.18: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân protein cá thát lát theo thời gian bởi CP- pepsin
Cơ chất thủy phân Cá thát lát 2%
Thời gian thủy phân (giờ) ΔV NaOH 0,1N (ml) ΔNFtạo thành (g/l) Hiệu suất thủy phân (%) 0 0,00 0,00 0,00 1 3,55 0,49 18,27 2 4,87 0,68 25,06 3 6,56 0,91 33,70 4 7,11 0,99 36,54 5 7,45 1,04 38,40 6 7,48 1,04 38,52 (Số liệu được trích từ bảng 5.14 phần phụ lục)
Đồ thị 3.3: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân các cơ chất protein bởi chế phẩm pepsin theo thời gian
Nhận xét: từ bảng 3.17, 3.18 và đồ thị 3.3 khi so sánh hiệu suất thủy phân trên cá thát lát và casein, chúng tơi nhận thấy: hiệu suất thủy phân cá thát lát đạt được là 38,52% cao hơn hiệu suất thủy phân casein, đạt được là 19,71%.
3.4.3 Khảo sát sự biến đổi tỷ lệ NF/NT theo thời gian thủy phân các cơ chất protein bởi chế phẩm pancreatin từ tụy tạng
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.10
3.4.3.1 Thủy phân casein
Kết quả hiệu suất thủy phân trình bày trong bảng 3.19
Hiệu suất thủy phân (%)
Bảng 3.19: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân casein theo thời gian bởi CP
pancreatin
(Số liệu được trích từ bảng 5.15 phần phụ lục)
3.4.3.2 Thủy phân cá thát lát
Kết quả hiệu suất thủy phân trình bày trong bảng 3.20
Bảng 3.20: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân cá thát lát theo thời gian bởi CP pancreatin
Cơ chất thủy phân Cá thát lát 2%
Thời gian thủy phân (giờ) ΔV NaOH 0,1N
(ml) Δ NFtạo thành (g/l) Hiệu suất thủy phân (%) 0 0,00 0,00 0,00 1 3,21 0,45 16,58 2 4,52 0,63 23,21 3 6,23 0,87 32,10 4 8,08 1,12 41,52 5 9,92 1,38 51,10 6 9,97 1,38 51,26 (Số liệu được trích từ bảng 5.16 phần phụ lục)
Cơ chất thủy phân Casein 2%
Thời gian thủy phân (giờ) ΔV NaOH 0,1N (ml) ΔNFtạo thành (g/l) Hiệu suất thủy phân (%) 0 0,00 0,00 0,00 1 5,44 0,75 8,79 2 10,11 1,41 16,41 3 14,43 2,01 23,37 4 18,94 2,63 30,79 5 21,97 3,05 35,61 6 23,57 3,28 38,21 7 23,64 3,29 38,37
Đồ thị 3.4: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân các cơ chất protein bởi chế phẩm pancreatin theo thời gian
Nhận xét: từ bảng 3.19, 3.20 và đồ thị 3.4 khi so sánh hiệu suất thủy phân trên cá thát lát và casein, chúng tơi nhận thấy: hiệu suất thủy phân cá thát lát đạt được là 51,26% cao hơn hiệu suất thủy phân casein, đạt được là 38,37%.
3.4.4 Khảo sát sự biến đổi tỷ lệ NF/NT theo thời gian thủy phân các cơ chất protein bởi chế phẩm protease từ ruột non
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.10.
3.4.4.1 Thủy phân casein
Kết quả thủy phân trình bày trong bảng 3.21
Hiệu suất thủy phân (%)
Bảng 3.21: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân casein theo thời gian bởi CPE từ ruột non
(Số liệu được trích từ bảng 5.17 phần phụ lục )
3.4.4.2 Thủy phân cá thát lát
Kết quả thủy phân trình bày trong bảng 3.22
Bảng 3.22: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân cá thát lát theo thời gian bởi CP protease từ ruột non
Cơ chất thủy phân Cá thát lát 2%
Thời gian thủy phân (giờ) ΔV NaOH 0,1N
(ml) Δ NF tạo thành (g/l) thủy phân (%) Hiệu suất
0 0,00 0,00 0,00 1 2,33 0,32 4,11 2 4,31 0,60 7,60 3 7,49 1,04 13,21 4 8,14 1,13 14,36 5 8,34 1,16 14,72 6 8,38 1,17 14,80 (Số liệu được trích từ bảng 5.18 phần phụ lục)
Cơ chất thủy phân Casein 2%
Thời gian thủy phân (giờ) ΔV NaOH 0,1N
(ml)
Thời gian thủy phân (giờ) Hiệu suất thủy phân (%) 0 0,00 0,00 0,00 1 1,67 0,23 2,95 2 2,76 0,38 4,87 3 3,72 0,52 6,57 4 4,63 0,64 8,18 5 5,36 0,75 9,46 6 5,52 0,77 9,74 7 5,58 0,78 9,85
Đồ thị 3.4: Sự biến thiên hiệu suất thủy phân các cơ chất protein bởi chế phẩm protease từ ruột non theo thời gian
Nhận xét: từ kết quả trong các bảng từ bảng 3.17 đến 3.22 chúng tơi nhận
thấy:
- Sau một khoảng thời gian thủy phân nhất định, hàm lượng N-formol tăng dần theo thời gian thủy phân, khoảng 3 giờ đầu quá trình thủy phân xảy ra mạnh và sau đĩ giảm dần, khi thời gian kéo dài được khoảng 7 giờ thì hàm lượng Nitơ-amin tăng chậm dần. Nguyên nhân cĩ thể do thời gian thủy phân kéo dài đã làm giảm hoạt tính của các enzym.
- Hiệu suất thủy phân dung dịch casein 2% bởi các chế phẩm enzym đạt được lần lượt là:
+ Pepsin: 19,71% + Pancreatin: 38,37% + Protease từ ruột non: 9,85%.
- Hiệu suất thủy phân dịch cá thát lát 2% của các chế phẩm enzym đạt được lần lượt là:
+ Pepsin: 38,52% + Pancreatin: 69,36% + Protease từ ruột non: 14,8%.
Hiệu suất thủy phân (%)
3.5 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐƠNG TỤ SỮA CỦA CÁC CHẾ PHẨM ENZYM THU ĐƯỢC
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp được trình bày ở mục 2.2.9
3.5.1 Xác định hoạt độ đơng tụ sữa của chế phẩm pepsin
Kết quả được trình bày trong bảng 3.23 và áp dụng cơng thức tính tốn theo mục 2.8.4
Bảng 3.23: Hoạt độ đơng tụ sữa của chế phẩm pepsin
Mẫu thí nghiệm 1 2 3
Thời gian đơng tụ trung bình (phút) 0,70 0,75 0,76
Hoạt độ F của CPE 286,00 265,67 263,33
Hoạt độ đơng tụ sữa (UI/gCPE) 114400,0 106266,7 105333,3
Hoạt độ đơng tụ sữa trung bình (UI/gCPE) 108666,7
(Số liệu được trích từ bảng 5.19 phần phụ lục)
Nhận xét: từ bảng 3.23 tơi nhận thấy: Hoạt độ F trung bình của chế phẩm
pepsin từ dạ dày là 271,67. Hoạt độ đơng tụ sữa trung bình: 108666,7 UI/g CPE
3.5.2 Xác định hoạt độ đơng tụ sữa của chế phẩm pancreatin từ tụy tạng
Kết quả được trình bày trong bảng 3.24 và áp dụng cơng thức theo mục 2.2.9.4
Bảng 3.24: Hoạt độ đơng tụ sữa của chế phẩm pancreatin
Mẫu thí nghiệm 1 2 3
Thời gian đơng tụ trung bình (phút) 1,35 1,32 1,26
Hoạt độ F của CPE 5,93 6,08 6,36
Hoạt độ đơng tụ sữa (UI/gCPE) 2373,3 2432,0 2538,7
Hoạt độ đơng tụ sữa trung bình (UI/gCPE) 2448
(Số liệu được trích từ bảng 5.20 phần phụ lục)
Nhận xét: từ bảng 3.24 tơi nhận thấy: Hoạt độ F trung bình của chế phẩm
pancreatin từ tụy tạng là 6,12. Hoạt độ đơng tụ sữa trung bình: 2448 UI/g CPE
Hoạt độ đơng tụ sữa của pepsin cao hơn so với pancreatin, vì vậy pepsin được sử dụng thay thế một phần Renin trong cơng nghiệp sản xuất phomat.
3.6 SO SÁNH HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHẾ PHẨM ENZYM THU NHẬN SO VỚI CÁC ENZYM TRONG DƯỢC PHẨM THƯƠNG MẠI.
3.6.1 Dược phẩm T-pepsin
3.6.1.1 Xác định hoạt độ protease của Dược phẩm T-pepsin
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.5.2, sử dụng kết quả đường chuẩn Tyrosin trong bảng 3.4 và đồ thị 3.1. Kết quả trình bày trong bảng 3.25.
Bảng 3.25: Hoạt độ protease của pepsin trong dược phẩm T-pepsin
Mẫu thí nghiệm 1 2 3
Giá trị ODKC 0,344 0,344 0,342
Giá trị ODTN 1,942 1,911 1,843
Giá trị Δ OD 1,598 1,567 1,501
Lượng Tyrosin (μmol) 0,97 0,95 0,91
Hoạt độ (UI/gCPE) 177,83 174,17 166,83
3.6.1.2 Xác định hàm lượng protein của Dược phẩm T-pepsin
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.4, sử dụng kết quả đường chuẩn Albumin trong bảng 3.6 và đồ thị 3.2.
Kết quả trình bày trong bảng 3.26
Bảng 3.26: Hàm lượng protein của dược phẩm T-pepsin
Mẫu thí nghiệm 1 2 3
Giá trị ODKC 0,022 0,023 0,022
Giá trị ODTN 0,374 0,371 0,373
Giá trị Δ OD 0,352 0,348 0,351
Hàm lượng protein ứng với Δ OD(μ/ml) 320,00 316,36 319,09 Hàm lượng protein mg/gCPE 160,00 158,18 159,55 Trung bình hàm lượng protein mg/gCPE 159,24
3.6.1.3 Hoạt độ riêng của pepsin trong Dược phẩm T-pepsin
Tiến hành tính tốn theo cơng thức trình bày ở mục 2.2.6. Kết quả trình bày trong bảng 3.27
Bảng 3.27: Hoạt độ riêng của pepsin trong dược phẩm
Mẫu thí nghiệm 1 2 3
Hoạt độ (UI/g CPE) 177,83 174,17 166,83
Hàm lượng protein mg / gCPE 160,00 158,18 159,55
Hoạt độ riêng(UI/mg protein) 1,11 1,10 1,05
Hoạt độ riêng trung bình (UI/mg protein) 1,09 Nhận xét: từ bảng 3.25, 3.26 và 3.27 nhận thấy:
- Hoạt độ protease của dược phẩm T-pepsin: 172,94 UI/g CPE
- Hàm lượng protein trung bình của dược phẩm T-pepsin: 159,24 mg/gCPE. - Hoạt độ riêng trung bình của dược phẩm T-pepsin: 1,09 UI/mg protein.
Như vậy, hoạt độ protease và hoạt độ riêng của enzym trong Dược phẩm T- pepsin thấp hơn so với hoạt độ của chế phẩm pepsin thu nhận được.
3.6.2 Dược phẩm cĩ chứa enzym pancreatin là Enzylstal và Enzyplex
3.6.2.1 Xác định hoạt độ protease của enzym trong Dược phẩm Enzylstal và Enzyplex
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.5.2, sử dụng kết quả đường chuẩn Tyrosin trong bảng 3.4 và đồ thị 3.1.
Bảng 3.28: Hoạt độ protease của enzym trong dược phẩm Enzylstal và Enzylex
Tên dược phẩm Enzylstal Enzyplex
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 1 2 3
Giá trị ODKC 0,073 0,067 0,069 0,078 0,070 0,064
Giá trị ODTN 1,444 1,325 1,330 0,820 0,753 0,798
Giá trị Δ OD 1,371 1,258 1,261 0,742 0,683 0,734
Lượng Tyrosin (μmol) 0,83 0,76 0,77 0,45 0,41 0,45
Hoạt độ (UI/g CPE) 608,67 557,33 564,67 825,00 751,67 825,00
Hoạt độ trung bình (UI/g CPE) 576,89 806,67
3.6.2.2 Xác định hàm lượng protein của dược phẩm Enzylstal và Enzyplex
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp Lowry trình bày ở mục 2.2.4, sử dụng kết quả đường chuẩn Albumin trong bảng 3.6 và đồ thị 3.2. Kết quả trình bày trong bảng 3.29
Bảng 3.29: Hàm lượng protein của dược phẩm Enzylstal và Enzyplex
Tên dược phẩm Enzylstal Enzyplex
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 1 2 3
Giá trị ODKC 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02
Giá trị ODTN 0,236 0,233 0,236 0,205 0,206 0,201
Giá trị Δ OD 0,215 0,212 0,215 0,184 0,185 0,180
Hàm lượng protein ứng với
Δ OD (μ/ml) 195,45 192,73 195,45 167,27 168,18 163,64 Hàm lượng protein mg/gCPE 432,72 416,36 394,54 845,45 804,55 813,65 Trung bình hàm lượng protein mg/gCPE 414,54 821,22
3.6.2.3 Hoạt độ riêng của dược phẩm Enzylstal và Enzyplex
Tiến hành tính tốn theo cơng thức trình bày ở mục 2.2.6.Kết quả trình bày trong bảng 3.30
Bảng 3.30: Hoạt độ riêng của dược phẩm Enzylstal và Enzyplex
Tên dược phẩm Enzylstal Enzyplex
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 1 2 3
Hoạt độ (UI/g CPE) 608,67 557,33 564,67 825,00 788,33 806,67 Hàm lượng protein
mg/gCPE
432,72 416,36 394,54 845,45 804,55 813,65 Hoạt độ riêng(UI/mg
protein) 1,41 1,34 1,43 0,98 0,93 1,01
Hoạt độ riêng trung bình
(UI/mg protein) 1,39 0,97
Nhận xét: từ bảng 3.28, 3.29 và 3.30 chúng tơi nhận thấy:
- Hoạt độ protease của Dược phẩm Enzylstal là 576,89 UI/g CPE và Enzyplex là:, 806,67 UI/g CPE.
- Hàm lượng protein trung bình của Dược phẩm Enzylstal là 414,54 mg/gCPE và Enzyplex: 821,22 mg/ gCPE.
- Hoạt độ riêng trung bình của enzym trong Dược phẩm Enzylstal là: 1,39 UI/mg protein và Enzyplex là 0,97 UI/mg protein.
Như vậy, hoạt độ protease và hoạt độ riêng của enzym trong dược phẩm Enzylstal và Enzyplex cao hơn hoạt độ protease và hoạt độ riêng của CP pancreatin thu nhận được.
3.6.3 So sánh hoạt độ protease của các chế phẩm enzym thu được với enzym trong các Dược phẩm thương mại
3.6.3.1 So sánh hoạt độ protease của chế phẩm pepsin với enzym trong Dược phẩm T-pepsin
Sử dụng kết quả được trình bày ở bảng 3.5, bảng 3.8, bảng 3.26 và bảng 3.28. Kết quả so sánh được trình bày ở bảng 3.31.
Bảng 3.31: So sánh hoạt độ chung và hoạt độ riêng của chế phẩm pepsin thu được với enzym trong Dược phẩm T-pepsin
Mẫu thí nghiệm CP pepsin tủa
bằng cồn CP pepsin tủa bằng muối (NH4)2SO4 T-pepsin
Hoạt độ (UI/gCPE) 532,89 953,33 159,24
Hoạt độ riêng (UI/mg protein) 1,31 2,85 1,09
Biểu đồ 3.5: So sánh hoạt độ protease của chế phẩm pepsin thu được với enzym trong Dược phẩm T-pepsin
Cồn 960 Muối (NH4)2SO4 T-pepsin
Các mẫu thí nghiệm
Hoạt độ pro
tease
Biểu đồ 3.6: So sánh hoạt độ riêng của chế phẩm pepsin thu được với enzym trong Dược phẩm T-pepsin
Nhận xét: từ bảng 3.31, biểu đồ 3.5 và 3.6 nhận thấy: hoạt độ protease và
hoạt độ riêng của enzym trong Dược phẩm T-pepsin thấp hơn hoạt độ của chế phẩm pepsin thu nhận được.
3.6.3.2 So sánh hoạt độ của chế phẩm pancreatin với enzym trong Dược phẩm Enzylstal và Enzyplex
Sử dụng kết quả được trình bày ở bảng 3.10, 3.12, 3.29 và bảng 3.31. Kết quả so sánh được trình bày ở bảng 3.32 và biểu đồ 3.7, 3.8
Bảng 3.32: So sánh hoạt độ chung và hoạt độ riêng của CP pancreatin với enzym trong dược phẩm Enzylstal và Enzyplex
Mẫu thí nghiệm CP pancreatin tủa bằng cồn CP pancreatin tủa bằng muối (NH4)2SO4 Enzylstal Enzyplex Hoạt độ (UI/g CPE) 151,55 253,41 576,89 800,56 Hoạt độ riêng (UI/ mg protein) 0,26 0,31 1,39 0,97
Cồn 960 Muối (NH4)2SO4 T-pepsin
Các mẫu thí nghiệm
Hoạt độ riêng (UI/m
g
protein
Biểu đồ 3.7: So sánh hoạt độ của chế phẩm pancreatin thu được với enzym trong Dược phẩm Enzylstal và Enzyplex
Biểu đồ 3.8: So sánh hoạt độ riêng của chế phẩm pancreatin thu được với