Thành phần amino acid: pepsin chứa nhiều amino acid cĩ tính acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. Phân tử pepsin heo chứa khoảng 36 nhĩm carboxyl tự do, trong khi đĩ chỉ chứa hai gốc arginine, một gốc lysine, một gốc histidine. Pepsin cũng chứa nhiều amino acid kỵ nước (theo Perlmann, 1959). Số lượng amino acid cĩ mạch nhánh khơng phân cực là lớn làm cho enzym dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong hỗn hợp chứa nhiều dung mơi phân cực.
Trọng lượng phân tử của pepsin là 34500 Dalton. Pepsin được tạo thành từ màng nhầy, ở các phần khác nhau của dạ dày thì tạo các dạng pepsin khác nhau (Tayloz và cộng sự, 1958). Ngồi pepsin A (được tách trước tiên) cịn tách được pepsin B, C, D và các pepsinogen tương ứng.
Pepsin đđược tách từ nguồn động vật khác nhau (heo, bị) và các pepsin khác nhau của cùng một nguồn các enzym (A, B, C, D) thì cĩ đơi chút khác nhau về tính chất và thành phần hĩa học.
Tính chất [11]
Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vơ định hình, trắng hay vàng nhạt, mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi
chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì cĩ vị ngọt ( Dược điển Việt Nam).
Pepsin dễ hút Nm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, khơng tan trong cồn 950, ester, chloroform.
Điểm đẳng điện của pepsin gần pH 1. Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1-4, pH tối ưu của pepsin thay đổi tùy theo bản chất và trạng thái của cơ chất, thường hoạt động tối ưu ở pH 1,7-2,2.
Pepsin bền nhất ở pH khoảng từ 4-5 nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzym cĩ phần giảm đi, cịn ở pH q thấp thì dung dịch pepsin kém bền nhất, khi đĩ xảy ra hiện tượng tự tiêu của enzym, kèm theo sự tạo thành các phân tử nhỏ (Ceply và cộng sự, 1980). Từ pH 5,5 trở lên pepsin khơng hoạt động.
Sự hoạt hĩa pepsinogen thành pepsin: pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin là pepsinogen bất hoạt, khi tiếp xúc với mơi trường acid tự nhiên của bao tử (do HCl được tiết ra bởi các tế bào đỉnh vách của mơn vị heo tạo ra) hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hĩa thành pepsin. Quá trình hoạt hĩa pepsinogen là quá trình thủy phân liên kết peptide giữa acid glutamic 41 và isoleucine 42 giải phĩng peptide kìm hãm (ng và cộng sự, 1968). Pepsin được tạo thành lại tiếp tục xúc tác q trình giải phĩng peptide kìm hãm chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động. Vì vậy q trình này mang tính chất của một q trình tự xúc tác. Sự hoạt hĩa pepsinogen chỉ xảy ra trong mơi trường acid cĩ pH < 5,6.
Sự tự tiêu của pepsin: pepsin vừa cĩ bản chất là protein vừa là enzym phân giải protein vì vậy pepsin cĩ khả năng phân hủy chính nĩ. Theo Ingram, sự tự tiêu của pepsin xảy ra trong trường hợp pepsin ở dạng dung dịch, pH thấp (pH=4), nhiệt độ thích hợp (khoảng 450C) tạo ra nhiều thành phần cĩ phân tử lượng nhỏ hơn
pepsin, giảm 45% lượng tyrosine và chỉ thành phần nào cĩ đặc tính của pepsin gốc thì mới hoạt động.
Khả năng thủy phân protein của pepsin: pepsin tác động lên hầu hết các protein tự nhiên nhưng lại khơng cĩ khả năng phân cắt triệt đđể protein thức ăn thành các amino acid riêng lẻ mà chỉ cắt sơ bộ khoảng 10 - 15% nối liên kết peptide của protein tạo thành sản phNm pepton cĩ trọng lượng phân tử nhỏ để chuNn bị cho những qúa trình tiêu hĩa triệt để ở những giai đoạn tiếp theo trong ruột non. Pepsin phân cắt một cách dễ dàng các protein tan trong nước như albumin, hemoglobin, mystin, globulin, canxi…cịn những protein khơng tan hay các nucleoprotein, protein hình sợi như keratin, neucin, glagen, gluten, các nucleoprotein…pepsin phân cắt rất khĩ hay khơng cắt được.
Tính chất đặc hiệu: của pepsin phụ thuộc vào loại pepsin. Pepsin A và D tính đặc hiệu xảy ra trong phạm vi rộng hơn pepsin B và C. Pepsin A, D thủy phân lên cả hai cơ chất Hb và APD ( acetyl-L-phenylalanine-L-diiodtyrosine), cịn pepsin B chỉ cĩ hoạt động lên APD cịn pepsin C chỉ tác động lên cơ chất Hb.
Tính chất đặc hiệu của pepsin thể hiện ở chỗ là pepsin chỉ cắt những liên kết peptide tạo thành do amino acid thơm như tyrosine, phenylalanine, tryptophan liên kết với các amino acid khác. Pepsin chỉ thủy phân những liên kết peptide, khơng tác dụng vào những mối liên kết amid. Ngồi ra, pepsin cịn thủy phân liên kết giữa Ala-Ala, Ala-Ser, nĩ cũng cắt liên kết giữa Leu-Val, Val-Cis, Glu-Asn, Leu-Glu nhưng ở mức độ thấp hơn.
Cũng như nhiều protease khác, ngồi việc phân cắt được liên kết peptide, pepsin cĩ khả năng phân cắt cả liên kết ester (Losins và cộng sự, 1954) hay những hợp chất ester sulfite cĩ nhân thơm và cĩ thể làm đơng tụ sữa (Teply và cộng sự, 1980).
1.2.1.4.3 Pancreatin [11]
Thành phần enzym
Pancreatin là hệ enzym thủy phân xúc tác các phản ứng chuyển hĩa đạm, tinh bột, đường, acid nucleic, chất béo và một số chất khác ở trong ruột. Các enzym này gồm cĩ: trypsin, chymotrypsin, elastase, colagenase, amylase, lactase, saccharase, lipase, aminopeptidase, nuclease…Pancreatin cĩ trong tụy động vật máu nĩng và người ta thường trích ly pancreatin từ tụy tạng của heo.
Tính chất
Pancreatin cĩ hoạt tính mạnh nhất trong mơi trường kiềm và bị bất hoạt trong mơi trường acid mạnh, nĩ hoạt động mạnh nhất từ 2 đến 3 giờ sau khi ăn để thực hiện q trình tiêu hĩa ở ruột non. Pancreatin cĩ thể pepton hĩa nhiều loại thức ăn như sữa, thịt, cháo…và chuyển dầu, chất béo thành dạng nhũ tương dễ tiêu hĩa.
1.2.1.4.4 Trypsin [11,43]
Khái niệm
Trypsin (E.C.3.4.21.4) cĩ trong dịch tụy và dịch ruột non của người và động vật. Trong cơ thể sinh vật, trypsin hoạt động trong mơi trường kiềm ở ruột, do đĩ được gọi là protease kiềm tính. Vai trị của trypsin là tiếp tục thủy phân các protein thức ăn cịn lại sau khi đã bị thủy phân một phần ở dạ dày tạo chủ yếu là dipeptide và các amino acid.
Đặc điểm cấu tạo
Trypsin là một chuỗi polypeptide cĩ 223 amino acid, trọng lượng phân tử 22680-23400Da. pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp của trypsin là 7,8-9,5. Tuy nhiên hoạt tính của dung dịch trypsin vẫn cĩ thể ổn định ở pH 3-5. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của trypsin là nhiệt độ cơ thể nhưng nĩ vẫn
trypsin cĩ khả năng thủy phân mạnh các loại cơ chất như casein, hemoglobin hay gelatin. Khi đun nĩng dung dịch lên đến 900C và pH trong khoảng 6-8 thì dung dịch enzym bị mất hoạt tính hồn tồn.
Trong mơi trường pH 8 và cĩ sự hiện diện của Ca thì enzym từ dạng khơng hoạt động chuyển thành dạng hoạt động. Khi khơng cĩ Ca thì enzym bị mất 50% hoạt tính do tạo thành protein trơ và enzym chỉ cịn lại 50% hoạt tính thủy phân. Như vậy Ca được xem như là chất bảo vệ cho enzym khỏi bị biến tính và bảo vệ chống lại sự tự thủy phân của trypsin.
Tính chất
Trypsin cĩ tác dụng trên hầu hết các cơ chất protein nhưng tác dụng của nĩ trên protein đã bị biến tính tốt hơn là trên protein chưa bị biến tính. Trypsin chỉ cĩ tác dụng trên hemoglobin, albumin biến tính của huyết tương, đối với collagen hay albumin trứng thì cần phải xử lý sơ bộ với nhiệt thì trypsin mới cĩ tác dụng.
Trypsin là một loại enzym thủy phân protein khơng triệt để, khi sử dụng trypsin thì chỉ cĩ 1/3 liên kết peptide trong phân tử protein là bị thủy phân, phần cịn lại là các peptide cĩ phân tử ngắn hơn và đơiđkhi cũng tạo ra các amino acid tự do như tryptophane, tyrosine. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tính đặc hiệu: trypsin cắt các liên kết được tạo bởi nhĩm carboxyl của lysine hay arginine với nhĩm amine của các amino acid bất kỳ và trypsin khơng cắt liên kết giữa lysine và arginine. Ngồi thủy phân liên kết peptide, trypsin cũng cĩ thể thủy phân liên kết ester.
Sự hoạt hĩa trypsinogen: trong tuyến tụy, đầu tiên trypsin được tiết ra dưới dạng khơng hoạt động là trypsinogen, sau đĩ được chuyển hĩa thành trypsin hoạt động dưới tác động của enzym đường ruột là enteropeptidase hoạt hĩa trypsinogen bằng cách cắt liên kết peptide giữa Lys6-Ile7 ở đầu chuỗi polypeptide, một đoạn
peptide gồm 6 amino acid (Val-(Asp)4-Lys) được tách ra khỏi chuỗi; hoặc bởi chính trypsin do nĩ cĩ tác dụng tự xúc tác, hiện tượng này chỉ xảy ra khi cĩ sự hiện diện một lượng nhỏ trypsin cịn lượng lớn sẽ làm ức chế quá trình này.
1.2.1.4.5 Chymotrypsin [11]
Khái niệm
Chymotrypsin (E.C.3.4.21.1) là một protease được tiết ra từ tuyến tụy, đây là một protease kiềm tính quan trọng sau trypsin.
Chymotrypsin được tiết ra dưới dạng khơng hoạt động đĩ là chymotrypsinogen, sau đĩ được chuyển thành dạng hoạt động là chymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin.
Đặc điểm cấu tạo
Chymotrypsin được cấu tạo từ ba sợi polypeptide: sợi A gồm các amino acid từ 1-13, sợi B gồm các amino acid từ 16-146, sợi C gồm các amino acid từ 149-246. Các sợi này liên kết với nhau bởi cầu nối disulfite. Các sợi polypeptide liên kết với nhau tạo thành dạng hình cầu. Cấu trúc thứ cấp của enzym cĩ dạng β. Enzym cĩ bộ ba amino acid xúc tác phản ứng là Ser195-His57-Asp102, những amino acid này tạo thành vị trí hoạt động của protein hỗ trợ cho hoạt động xúc tác.
Chymotrypsin là một chuỗi polypeptide cĩ 246 amino acid, trọng lượng phân tử 22500 Da.
Tính chất
Chymotrypsin hoạt động trong điều kiện pH 7-9 và pH tối ưu là 8-9, điểm đẳng điện là pI 5,4. Ơû pH 5 khơng thuận lợi cho hoạt động của chymotrypsin nhưng ở pH này nĩ lại bền vững hơn trong mơi trường pH 8 (mơi trường kiềm dễ làm phân hủy trypsin và chymotrypsin).
Hoạt động thủy phân của chymotrypsin: trong ruột, chymotrypsin thủy phân protein và các sản phẩm đã được tiêu hĩa một phần bởi pepsin để tạo ra các peptide ngắn và các amino acid tự do. Hoạt tính của nĩ tương đối yếu hơn trypsin nhưng lại cĩ khả năng thủy phân protein sâu sắc hơn.
Tính chất đặc hiệu: chymotrypsin tác dụng trên những liên kết mà trypsin khơng tác động, những liên kết này được tạo thành bởi nhĩm carboxyl của amino acid cĩ nhân thơm như tyrosine, tryptophane, phenylalanine với nhĩm amin của amino acid khác. Tương tự trypsin, ngồi khả năng phân cắt các liên kết peptide nĩ cịn cĩ khả năng tác dụng lên các liên kết ester.
R1 là gốc amino acid cĩ nhân thơm ( Tyr, Try, Phe) R2 là gốc amino acid bất kỳ
Sự hoạt hĩa chymotrypsinogen: trong quá trình chymotrypsinogen được chuyển hĩa thành chymotrypsin hoạt động nhờ trypsin, khi đĩ cĩ sự xuất hiện trung tâm hoạt động của enzym. Khi trypsin phân cắt liên kết giữa hai amino acid 15 (arginine) và 16 (isoleucine) trong chuỗi polypeptide sẽ tạo thành π-chymotrypsin cĩ hoạt tính thủy phân nhưng khơng bền. Sau đĩ trypsin tiếp tục cắt đứt liên kết giữa amino acid 14 (serine) và 13 (aginine) để tạo thành δ-chymotrypsin. Sau cùng tách một dipeptide của đoạn amino acid 148 và 149 (threonine và asparagine) sẽ hình thành α-chymotrypsin là một cấu trúc được giữ bằng 5 cầu nối disulfur. Sự thay đổi này tạo nên trung tâm hoạt động của enzym.
Ch ymotrypsin
-CO-NH-CH-CO NH-CH- -CO-NH-CH-CO + NH-CH-
1.2.1.4.6 Các protease và peptidase khác [16,33,43,44,46,70]
Ngồi các enzym tiêu hĩa được thu nhận từ dạ dày, tụy tạng như pepsin, trypsin, chymotrypsin cịn cĩ những protease, peptidease khác cũng được thu nhận từ tụy và ruột non.
Carboxypeptidase: là một peptidase của dịch tụy, hoạt động ở mơi trường kiềm, thủy phân các liên kết peptide cạnh nhĩm carboxyl ở tận cùng (đầu C).
-CO – NH – CH - COOH R
Carboxypeptidase
Carboxypeptidase được tạo ra ở dạng bất hoạt là procarboxypeptidase và được tiết vào ruột non và sau đĩ được hoạt hĩa nhờ trypsin. Cĩ hai loại carboxypeptidase đĩ là carboxypeptidase A và B, cả hai đều là exopeptidase. Carboxypeptidase A là một enzym chứa kim loại là kẽm, đặc hiệu đối với amino acid thơm ở đầu C, trong khi đĩ carboxypeptidase B đặc hiệu đối với amino acid kiềm ở đầu C. Carboxypeptidase hoạt động mạnh nếu amino acid tận cùng là phenylalanine và khơng hoạt động nếu amino acid là proline hay hydroxyproline.
Elastase cĩ trong dịch tụy, tác động lên elastin cũng như một vài protein khác và tiêu hĩa chúng thành các amino acid.
Aminopeptidase: là enzym được tạo ra bởi các tuyến của ruột non, hoạt động trong mơi trường kiềm, thủy phân các liên kết peptide cạnh nhĩm amino tự do và giải phĩng amino acid do cắt liên kết peptide cạnh nhĩm amino đĩ.
NH2 – CH – CO – NH -… R
- Những enzym aminopeptidase như EC 3.4.11.1, EC 3.4.11.2, EC 3.4.11.3 là những enzym phân cắt các peptide từ đầu N của các amino acid trung tính.
- Những enzym như EC 3.4.13.8 là đặc hiệu đối với những cơ chất dipeptide.
- Những enzym như EC 3.4.15.1 phân cắt thành những đơn vị dipeptide từ đầu C (Maroux et al.,1973; Feracci and Maroux, 1980) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dipeptidase: cĩ trong dịch ruột, nĩ tác động lên các dipeptide đặc hiệu ví dụ
như glycyl-glycine peptidase tác động lên dipeptide glycyl-glycine nhưng khơng tác động lên tripeptide glycyl-glycyl-glycine. Như vậy rõ ràng dipeptidase địi hỏi cĩ cả nhĩm amino tự do và carboxyl tự do gần liên kết peptide mà nĩ tác động để giải phĩng các amino acid tự do.
1.2.1.5 Phương pháp thu nhận các protease từ phế liệu lị mổ động vật 1.2.1.5.1 Phương pháp thu nhận Rennin [11]
Phương pháp thu nhận rennin
Thu rennet từ dạ dày bê con thường được chuẩn bị ngay ở lị mổ bằng cách sấy khơ hoặc ướp muối, lớp dạ dày được gỡ ra cịn nguyên, được thổi phồng lên bằng khơng khí và được làm khơ. Dạ dày khơ sẽ được chiết tách bằng dung dịch NaCl.
Dịch rennet được chiết chứa rennin hoạt động và tiền rennin bất hoạt, thêm acid vào để sự chiết đạt hiệu quả tối đa. Thường người ta cũng tách chiết rennin bằng HCl tương tự pepsin.
Phương pháp thu dung dịch rennin
Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi. Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn ngược nhẹ để bỏ hết thức ăn dư, bỏ mỡ, cân trọng lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh, sau đĩ rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%.
- Phương pháp 1:
+ Dạ dày bê xay nhuyễn
+ HCl 0,2% Tỷ lệ 1 : 3 theo V
+ Cho vào 0,7% acid boric trên tổng V
- Phương pháp 2:
+ Dạ dày bê xay nhuyễn
+ Nước muối 10% Tỷ lệ 1 : 3 theo V
+ Chỉnh bằng HCl về pH 4
Cho 0,7% acid boric trên tổng V ( cĩ tác dụng bảo quản). Giữ ở 35-400C cả hai mẫu qua 30 giờ trong tủ ấm. Sau đĩ dùng HCl N chỉnh lại pH của dung dịch của hai phương pháp về pH 4. Lấy ra đđem lọc qua vải màn và vải nhiều lớp được dịch trích rennin thơ.
Dịch rennet được bảo quản ở nồng độ muối cao 14-20% và thêm chất bảo
quản như Na-benzoate và propylene-glycol. Dịch rennet và rennet bị thu nhận cĩ màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu trắng đến nâu nhạt.
Phương pháp thu rennin thơ
Dịch rennet được thực hiện kết tủa bằng cách acid hĩa dung dịch hoặc dung dịch bão hịa với NaCl hoặc cả hai cách. Gelatin thường được thêm vào để giúp sự kết tủa và tách rennin ra khỏi dung dịch bằng ly tâm 45 phút.
Thu rennin dạng bột: tủa enzym theo phương pháp diêm tích với muối trung tính bằng cách cho từ từ vào dịch trích rennin thơ một lượng NaCl tinh thể nồng độ khoảng 22-23% cho đến khi đạt sự bão hịa NaCl. Để lạnh 20 phút sau đĩ lấy ra ly tâm hay lọc, thu tủa, sấy khơ rồi để vào bình hút ẩm.
- Dạ múi khế của dạ dày bê non được cắt nhỏ, điều chỉnh đến pH 2-3 bằng acid HCl và ủ ở 420C để hoạt hĩa tiền enzym prorennin thành rennin được điều chỉnh pH gần 5,5 với Na2PO4. Sự cĩ mặt của phosphat, hỗn hợp trở thành dung dịch và làm khơ ở chân khơng tạo dạng bột.
- Dạ dày bê làm khơ và nghiền. Bột thì khuấy đều trong vài ngày với dung dịch HCl chứa chất bảo quản. Dịch chiết được tách khỏi phần khơng hịa tan và được acid hĩa bằng dung dịch HCl thích hợp để tủa phần nhầy. Enzym bị tủa tiếp tục bằng NaCl vừa đủ để dung dịch bão hịa, lọc và làm khơ ở nhiệt độ phịng. Sản phẩm chứa ít muối nhưng ít protein tinh khiết.