Nồng độ Albumin μg/ml 0 50 100 150 200 250
Nước cất (ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5
Dung dịch Albumin 0,1% (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Hút 0,4 ml dung dịch Albumin cĩ nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo theo thứ tự vào bảy ống nghiệm sạch khác (gồm 2 ống thử khơng và năm ống từ 2-6). Thêm vào mỗi ống nghiệm 2ml dung dịch C, lắc đều, để yên ở nhiệt độ phịng trong 10 phút, sau đĩ thêm 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều để trong 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml và đem đo mật độ quang ở bước sĩng 750nm.
Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm: hút 0,4 ml dung dịch protein cần
phân tích, thêm vào mỗi ống nghiệm 2ml dung dịch C, lắc đều, để yên ở nhiệt độ phịng trong 10 phút, sau đĩ thêm 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều để trong 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml và đem đo mật độ quang ở bước sĩng 750mm.
Mỗi mẫu phân tích được làm 3 ống để lấy giá trị trung bình, nếu màu vượt ngồi đường chuẩn thì phải pha lỗng mẫu.
2.2.4.4 Cơng thức tính
Hàm lượng protein trong 1g mẫu:
M = (a x 10-3 x n)/ m (mg/ml) Trong đĩ: a: Lượng protein của mẫu (μg/ml).
n: Hệ số pha lỗng.
2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ protease
2.2.5.1 Xác định hoạt độ pepsin theo Dược Điển Việt Nam [5,14]
Lấy một quả trứng gà đem luộc chín, sau đĩ làm nguội, bĩc vỏ và tách riêng lịng đỏ và lịng trắng. Nghiền nhỏ lịng trắng trứng qua rây mịn.
Cân 10g lịng trắng trứng đã được nghiền qua rây, thêm một ít nước ở 50- 600C tạo hỗn hợp đồng đều rồi chuyển sang một bình tam giác cĩ dung tích 200ml. Rửa cối nghiền bằng nước ấm 50-600C để tổng thể tích hỗn hợp lúc này là 85ml.
Giữ hỗn hợp đĩ ở 450C. Thêm 0,9ml HCl đậm đặc, lắc trộn đều. Thêm 0,1g chế phẩm enzyme đã pha lỗng 5ml nước ở 450C. Rửa lại cốc đựng chế phẩm enzyme với 10ml nước ở 450C.
Giữ bình tam giác trong một nồi cách thủy ở nhiệt độ 40-500C để quá trình thủy phân protein trứng xảy ra. Ghi lại thời gian bắt đầu quá trình thủy phân, khi protein trứng được thủy phân hồn tồn thì ghi lại thời gian kết thúc. Trong thời gian thủy phân cần khuấy đều thường xuyên.
Tiêu chuẩn hoạt tính enzyme theo DĐVN là tất cả lịng trắng trứng phải tan hết tạo thành một dung dịch đục lờ, đồng nhất trong thời gian từ 3-4 giờ. Được phép cĩ một lượng khơng đáng kể của màng vỏ trứng. Như vậy kết luận chế phẩm enzyme đạt tiêu chuẩn tiêu đạm theo Dược Điển Việt Nam.
2.2.5.2 Xác định hoạt độ protease theo Anson cải tiến [1,6,8,13]
2.2.5.2.1 Nguyên tắc
Cho protease tác dụng với cơ chất là albumin (hoặc casein; hemoglobin), sau đĩ kết tủa protein dư thừa bằng tricloacetic acid (TCA), sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay acid amin (trong đĩ tyrosine, tryptophan chiếm phần lớn). Xác
63
định lượng tyrosine, tryptophan bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đĩ xác định hoạt độ protease.
Biểu diễn hoạt độ bằng số đơn vị hoạt độ (g/CPE). Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong 1 phút ở 35,50C phân giải được một lượng protein tương đương với 1 μmol tyrosine.
2.2.5.2.2 Hĩa chất
- Dung dịch tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 0,118 tyrosine trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml. Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l: pha lỗng 5ml tyrosine 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100ml.
- Dung dịch HCl 0,2N, dung dịch NaOH 0,5N, dung dịch HCl 0,06N. - Dung dịch TCA 10%
- Dung dịch albumin 1%
2.2.5.2.3 Tiến hành
Phương pháp dựng đường chuẩn Tyrosine
Bảng 2.2: Pha dung dịch Tyrosine chuẩn cĩ lượng Tyrosine từ 0-1 μmol
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch Tyrosine chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
HCl 0,2N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2
TT Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Lắc đều và để yên 10 phút sau đĩ đem đo mật độ quang ở bước sĩng 660nm.
Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu
Bảng 2.3: Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu
Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử khơng (3 ống) Albumin1% (ml) 5 5 Dd TCA10% (ml) 0 5 Dịch enzyme mẫu (ml) 1 0
Lắc đều và giữ ở 35,50C trong 30 phút
Dd TCA 10% (ml) 5 0
Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1
Để yên 30 phút sau đĩ lọc và lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (ml) 1 1
Dd NaOH 0,5N (ml) 2 2
TT Folin (ml) 0,6 0,6
Lắc đều, để yên 10 phút và đo mật độ quang ở bước sĩng 660nm
2.2.5.2.4 Cơng thức tính
Hoạt độ protease
65
Trong đĩ: y: số μmol Tyrosine suy ra từ đường chuẩn
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml)
K: độ pha lỗng mẫu
t: thời gian thực hiện phản ứng (30 phút) m: khối lượng CP enzyme phân tích (g)
2.2.6 Hoạt độ riêng của enzym [11]
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzym là tỷ lệ giữa tổng đơn vị hoạt độ của enzym với hàm lượng protein cĩ trong chế phẩm. Hoạt độ riêng thường được sử dụng để xác định mức độ tinh sạch của chế phẩm thu được.
Cơng thức tính hoạt độ riêng:
∑ ĐVHđ
HđR = (UI/mg Pr-E) mg Protein
2.2.7 Xác định Nitơ-formol (NF) theo phương pháp Sorensen [1,6,12]
2.2.7.1 Nguyên tắc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong một hỗn hợp gồm protein, peptid, amino acid, amin, ammoniac…để xác định gần đúng loại đạm “phi protein” người ta thường dùng phương pháp Sorensen.
Các amino acid, oligopeptid, peptid trong dung dịch nước cĩ tính trung tính vì trong phân tử cĩ một đầu chức acid (-COOH) và đầu kia là chức amin (-NH2) trung hịa lẫn nhau; cịn các amin tự do cũng như ammoniac khi hịa tan thường ở dưới dạng ammonium NH4+ kết hợp với anion thường là clorua, sulfat, phosphat… Vì vậy, khi cho các phân tử “phi protein” này tác dụng với formol, formol sẽ tác dụng lên nhĩm (-NH2) tạo thành phức chất metilen (-N=CH2) làm mất tính chất kiềm, do đĩ
cịn tính chất acid của nhĩm (-COOH), ta cĩ thể định phân bằng NaOH với phenolphthalein làm chỉ thị màu. Vì số nhĩm carboxyl tự do bằng số nhĩm amin liên kết với formol, nên khi chuẩn độ nhĩm carboxyl thì sẽ xác định được một cách gián tiếp lượng (-NH2) trong dung dịch nghiên cứu.
2.2.7.2 Tiến hành
- Dung dịch formol trung hịa ½: lấy một thể tích formol ½ cần dùng thêm vào đĩ vài giọt phenolphthalein 3%, cho NaOH 0,1N từng giọt cho tới khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, ta được dung dịch formol ½ đã trung hịa.
- Hút 10ml dung dịch từ dung dịch nguyên liệu đã được pha lỗng với tỉ lệ thích hợp, thêm vào đĩ 10ml dung dịch formol ½ đã trung hịa và vài giọt phenolphthalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hồn tồn, sau đĩ định phân bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng.
- Thực hiện ba thử thật và ba thử khơng (thay dung dịch đạm bằng nước cất) lấy trị số trung bình)
- Một số trường hợp mẫu ngun liệu cĩ màu, vì vậy rất khĩ xác định điểm trung hịa, ta cĩ thể xử lý theo hai cách:
+ Pha lỗng nguyên liệu để màu nhạt bớt.
+ Khơng sử dụng chỉ thị màu là phenolphthalein nữa mà dùng pH kế.Trước hết ta trung hịa ngun liệu tới pH 8, sau đĩ thêm formol ½ vào (cũng đã được chỉnh
R-CH-COOH + HCHO R-CH-COOH + H2O
NH2 N=CH2
R-CH-COOH + NaOH R-CH-COONa + H2O
67
lên pH 8), kế đĩ định phân bằng NaOH 0,1N cho đến khi pH dung dịch trở lại pH 8. Ghi nhận thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng.
2.2.7.3 Cơng thức tính
Số gam Nitơ-formol (NF) cĩ trong 1 lít dung dịch thủy phân: NF = 14 x ∆V x y x 10-2 (g/l)
Trong đĩ ∆V: hiệu số giữa thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật với 3 lần thử khơng (ml)
y: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH 0,1N
2.2.8 Xác định Nitơ-tổng số (NT) theo phương pháp Kjeldahl [1,2,6,13]
2.2.8.1 Nguyên tắc
Tất cả các dạng nitơ cĩ trong cơ thể hay trong các mơ được gọi là nitơ tổng số. Nitơ cĩ trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ khơng cĩ trong thành phần protein như của các muối vơ cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptid, ure và các dẫn xuất của ure… là nitơ phi protein.
Nitơ tổng số= nitơ protein + nitơ phi protein
Trước tiên chất đạm được vơ cơ hĩa bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và cĩ chất xúc tác, các hợp chất chứa nitơ bị phân hủy và bị oxy hĩa đến CO2 và H2O, cịn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành dạng ammonium sulfat.
Chất đạm sau khi vơ cơ cho tác dụng với NaOH đậm đặc sẽ phĩng thích ra amoniac. Lượng amoniac phĩng thích ra được hơi nước lơi cuốn bằng một dụng cụ là máy Parnas-Wargner và được dẫn đến một bình tam giác cĩ chứa H3BO3. Từ đây cho phép chúng ta xác định được lượng ammoniac phĩng thích ra, cĩ nghĩa là xác định hàm lượng Nitơ trong mẫu nguyên liệu.
m
2.2.8.2 Tiến hành
Vơ cơ hố ngun liệu
Cân 1g mẫu tươi hoặc 0,1 đến 0,3g mẫu khơ đã nghiền nhỏ. Cho mẫu vào bình Kjeldahl. Nếu mẫu lỏng thì dùng pipet, hút 2 đến 5ml cho vào bình Kjeldahl thêm 5 ml H2SO4 đậm đặc và 0,5 xúc tác (hỗn hợp 9K2SO4:1CuSO4). Để nghiêng bình trên bếp đặt trong tủ hoffer đun khoảng 2-3 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt và cĩ màu xanh da trời nhạt, để nguội. Chuyển dịch sang bình định mức 50ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vơ đạm và dẫn nước cất đến vạch định mức.
Cất đạm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đặt bình hứng (cĩ chứa 20ml H3BO3 3% thêm vài giọt chỉ thị Tasiro) vào vịi ống sinh hàn. Hút 10ml dung dịch đã vơ cơ hố, cho vào phễu của máy cất đạm và mở khố cho vào bình phản ứng, tráng phễu bằng nước cất.
Cho 10ml dung dịch NaOH đậm đặc chảy xuống bình phản ứng từ từ, tráng một ít nước cất, dung dịch trong bình phản ứng sẽ đổi màu. Để máy lơi cuốn trong 5 phút rồi hạ bình tam giác xuống để thêm 2 phút nữa. Định lượng (NH4)2B4O7 tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N, dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang màu tím đỏ. Ghi nhận thể tích H2SO4 dùng chuẩn độ
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO3
2.2.8.3 Cơng thức tính
Hàm lượng Nitơ tổng số (NT) cĩ trong mẫu được tính theo cơng thức sau: V x 1,42 x (50/10)
69
Trong đĩ: V: Dung dịch H2SO4 0,1N dùng để chuẩn độ (ml) 1,42: Số mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N
m: mẫu phân tích (mg hoặc ml) Hàm lượng protein thơ (%) = % N-tổng số x 6,25
2.2.9 Phương pháp xác định hoạt độ đơng tụ sữa [3,7]
2.2.9.1 Nguyên tắc
Xác định hoạt độ đơng tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đơng tụ dung dịch sữa cĩ nồng độ xác định.
Để so sánh hoạt độ đơng tụ sữa (F) của các chế phẩm enzym khác nhau, ta dùng tích số giữa lượng enzym (E) và thời gian (t) đơng tụ sữa. Tích số (E x t) càng lớn thì hoạt độ đơng tụ càng thấp.
2.2.9.2 Hĩa chất
Bột sữa đã tách béo 10% pha trong CaCl2 0,01M.
2.2.9.3 Tiến hành
Cho 5ml dung dịch sữa (10% trong CaCl2 0,01M) vào ống nghiệm, để ở 350C trong 5 phút, sau đĩ cho vào ống 0,5ml dung dịch enzym, lắc nhẹ và tiếp tục giữ ở 350C, ghi thời gian từ khi cho enzym vào đến khi xuất hiện kết tủa protein của sữa trên thành ống nghiệm.
Dung dịch enzym cần pha lỗng thích hợp để thời gian đơng tụ sữa vào khoảng 5 phút.
2.2.9.4 Cơng thức tính
Hoạt độ đơng tụ sữa (F) được tính theo cơng thức: 1
F = E x t
E : lượng enzym, nếu ở dạng bột thì đơn vị làgam, nếu là dạng lỏng thì đơn vị tính là ml. Thể tích dung dịch enzym trong thí nghiệm là 0,5ml.
t : thời gian đơng tụ (phút hoặc giây)
Cơng thức tính hoạt tính đơng tụ sữa (HđĐt sữa) HđĐt sữa = 400 x F
Hoạt độ đơng tụ sữa trong 1 phút tương đương 400 UI. Hoạt độ đơng tụ sữa của các chế phẩm enzym tính bằng UI/ml (E) hay UI/g (E)
Chú ý: để xác định được chính xác thường làm ba ống nghiệm song song, thêm enzym vào mỗi ống cách nhau 1 phút, và sau đĩ lấy giá trị trung bình. Thời gian đơng tụ sữa ở ba ống chỉ cách nhau vài giây.
2.2.10 Xác định sự biến đổi hàm lượng N-formol theo thời gian thủy phân
protein của enzym [1,2]
2.2.10.1 Nguyên tắc
Thực hiện nghiên cứu quá trình thủy phân protein theo thời gian: sau một khoảng thời gian nhất định (cách nhau 60 phút) lấy dung dịch thủy phân và xác định N-formol theo phương pháp chuẩn độ formol. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vẽ đồ thị biến thiên N-formol theo thời gian thủy phân.
2.2.10.2 Hĩa chất
71
- Dung dịch formol ½; NaOH N/10; Phenolphtalein 3% pha trong cồn
2.2.10.3 Tiến hành
Chuẩn bị hai erlen:
- Bình 1 (thí nghiệm): cho vào bình 10ml dung dịch cơ chất, thêm 5ml dung dịch enzym protease, lắc đều, giữ ở nhiệt độ 400C trong 1 giờ. Sau 1 giờ lấy erlen ra khỏi tủ ấm thêm 10ml formol ½ đã trung hịa và vài giọt phenolphtalein 3% và chuẩn độ bằng NaOH N/10 cho đến khi xuất hiện màu hồng.
- Bình 2 (kiểm chứng): cũng làm tương tự như bình 1 nhưng cho dung dịch formol ½ đã trung hịa vào với dung dịch cơ chất, lắc đều, rối mới cho dung dịch enzym vào, sau đĩ cũng tiến hành chuẩn độ cho đến khi xuất hiện màu hồng giống với màu bình 1.
2.2.10.4 Cơng thức tính
Lượng NF tạo thành: Δ NF = NF sau thời gian thủy phân (t) - NF ban đầu (t=0) Lượng N-formol thu được trên 1 lít dung dịch thủy phân:
1,4. Δ V. x
NF (g/l) =
v
Trong đĩ: x là hệ số chỉnh lý dung dịch NaOH N/10
Δ V là lượng NaOH trung hịa nhĩm –COOH (ml)
2.2.11 So sánh giữa các chế phẩm enzym thu được với các enzym cĩ trong Dược phẩm thương mại
Mục đích so sánh là để đánh giá hoạt độ của chế phẩm enzym thí nghiệm thu được với protease cĩ trong các dược phẩm thương mại. Phương pháp xác định hoạt độ đã được nêu ở mục 2.2.5.2 và 2.2.6.
Chỉ tiêu so sánh: - Hoạt độ chung - Hoạt độ riêng
2.2.12 Phương pháp thu nhận pepton-pepsic và pepton pancreatic [5,20,21,30] 2.2.12.1 Nguyên liệu: tận dụng nguồn enzym và protein sẵn cĩ của dạ dày và tụy tạng để tự phân thu nhận sản phẩm pepton- pepsic từ dạ dày và pepton- pancreatic từ tụy.
2.2.12.2 Thu nhận pepton-pepsic [21]
Sơ đồ 2.5:
Quy trình thu nhận pepton-pepsic
Cơ đặc trên bình cách thủy ở 600C
Sau một thời gian thử dung dịch với acid Nitric khơng cĩ kết tủa trắng
Lọc thu dung dịch
Trung hịa dịch lọc đến pH 7 bằng NaHCO3 Dạ dày
Rửa nhẹ, loại mỡ, mơ liên kết Cắt nhỏ và xay nhuyễn
Cân
HCl 0,5% Tự phân ở 40-450C
73 Lọc thu dung dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cơ đặc trên bình cách thủy ở 600C Cân
Cắt nhỏ và xay nhuyễn Tụy tạng heo hay bị Rửa nhẹ, loại mỡ, mơ liên kết
NaHCO3 1,25% (1:2), vài giọt toluen Tự phân vài giờ ở 20-300C
Sau một thời gian thử dung dịch với acid Nitric khơng cĩ kết tủa trắng
Trung hịa dịch lọc đến pH 7 bằng
Sản phẩm pepton-pancreatic
Mơ tả quy trình: Dạ dày sau khi thu nhận sẽ được rửa nhẹ dưới vịi nước để
loại thức ăn thừa, loại bỏ mỡ và các mơ liên kết. Tiếp đĩ dạ dày được cắt nhỏ và xay nhuyễn để phá vỡ tế bào, cân ghi lại trọng lượng dạ dày. Cho dung dịch HCl 0,5% vào dạ dày đã xay nhuyễn để tạo pH thích hợp cho enzym hoạt động theo tỷ lệ 1:2, sau đĩ để dung dịch vào tủ ấm 40-450C để enzym thủy phân. Sau một thời gian lấy dung dịch thử với acid nitric thấy khơng cĩ xuất hiện kết tủa trắng là quá trình thủy phân kết thúc. Lọc nhiều lần lấy nước trong, trung hịa dung dịch bằng NaHCO3 đến pH 7 rồi cơ đặc dung dịch trên bình cách thủy 600C thu sản phẩm dạng đặc sệt. Sản phẩm cĩ màu vàng giống mạch nha, mùi thơm đặc trưng.
Lấy dịch lọc đem xác định hàm lượng Nitơ-formol và Nitơ-tổng số theo mục 2.2.7 và 2.2.8. Tỷ lệ N-formol/ N-tổng của pepton-pepsic phải đạt nhỏ hơn 20% (khoảng từ 7-17%). 2.2.12.3 Thu nhận pepton-pancreatic [21]
Sơ đồ 2.6: Quy trình thu nhận pepton-pancreatic pepton-pancreatic
Mơ tả quy trình: tụy tạng sau khi thu nhận sẽ được rửa nhẹ, loại bỏ mỡ và