Tụy được cấu tạo từ hai loại tế bào gọi là tế bào ngoại tiết và tế bào nội tiết. 98% là các tế bào ngoại tiết hoặc tế bào tuyến, các tế bào này tiết enzym vào trong tá tràng giúp tiêu hĩa chất béo, protein và carbohydrate trong thực phẩm; 2% cịn lại là các tế bào nội tiết, tiết hormon vào mạch máu để duy trì sự cân bằng glucose trong máu.
Tế bào nội tiết cĩ bốn dạng chính là tế bào α, β, δ và PP. Tế bào β sản xuất insulin, tế bào α tiết glucagon, tế bào δ tiết somotostatin và tế bào PP tiết ra các polypeptide của tụy.
1.2.1.3.3 Ruột non [36,50,72]
Đặc điểm cấu tạo
Ruột non là một cơ quan tiêu hĩa quan trọng của cơ thể. Ruột non cuộn thành nhiều vịng trong ổ bụng, và nếu kéo dãn ra nĩ sẽ cĩ chiều dài khoảng 6m tính từ dạ dày đến ruột già. Tại điểm nối với dạ dày, ruột non cĩ đường kính khoảng 4cm. Đến khi nối với ruột già, đường kính của nĩ giảm xuống cịn 2,5cm. Ruột non chia làm ba phần:
- Phần đầu tiên là tá tràng, cĩ chiều dài khoảng 25cm, gần với dạ dày nhất. Dưỡng trấp từ dạ dày và các dịch tiết từ tụy và gan được đổ vào tá tràng.
- Phần giữa là hổng tràng, dài khoảng 2,5cm, sự tiêu hĩa và hấp thụ chất dinh dưỡng xảy ra chủ yếu ở đây.
- Phần cuối cùng là hồi tràng, nĩ là phần dài nhất khoảng 3,4m, hồi tràng kết thúc bởi van hồi tràng, là một cơ vịng để kiểm sốt lưu lượng dưỡng trấp đi từ hồi tràng đến ruột già.
Thành ruột non gồm cĩ 4 lớp mỏng: lớp màng bọc bên ngồi, lớp cơ (cơ dọc, cơ vịng), lớp niêm mạc (tiết dịch ruột và chất nhầy) và lớp dưới niêm mạc.
Niêm mạc ruột non cĩ nhiều nếp nhơ lên là van ruột. Trên mặt van ruột cĩ các nếp gấp nhỏ hơn gọi là nhung mao. Nhung mao được phủ một lớp liên bào hình trụ là tế bào hấp thu, trên bề mặt mỗi tế bào cĩ 1500-4000 vi nhung mao (cịn gọi là bờ bàn chải). Do cấu trúc như vậy nên diện tích của niêm mạc ruột tăng lên nhiều lần, làm gia tăng đáng kể bề mặt tiếp xúc của ruột non để hấp thu các chất dinh dưỡng. Trong mỗi nhung mao cĩ các mao mạch và mạch bạch huyết. Các phân tử thức ăn đã được tiêu hĩa sẽ được hấp thu qua thành của các nhung mao vào trong các mao mạch và mạch bạch huyết. Trên mặt và khe giữa các vi nhung mào cĩ các siêu nhung mao đan chéo nhau tạo nên hệ thống lưới 3 chiều gọi là glycocalyx, cĩ vai trị lớn trong q trình tiêu hĩa hấp thu ở ruột. Ơû đáy các nhung mao cĩ các tuyến tiết ra dịch ruột. Dịch này cĩ chứa các enzym tiêu hĩa cĩ khả năng chuyển thức ăn thành những dạng cấu tạo đơn giản hơn mà cơ thể cĩ thể sử dụng được. Trung bình cĩ khoảng 1,8 lít dịch ruột được tiết ra vào ruột non mỗi ngày.
Cũng như trong dạ dày, lớp dịch nhầy bao phủ bên trên giúp bảo vệ niêm mạc của ruột non. Vì các enzym tiêu hĩa cĩ tác dụng mạnh nên các tế bào niêm mạc này được thay mới hồn tồn sau mỗi hai ngày.
Sự tiêu hĩa protein và polypeptide trong ruột non [9,35,46,50,70]
Tiêu hĩa protein bắt đầu ở dạ dày và được hồn thành ở ruột non nhờ các protease của tuyến tụy và ruột. Ngồi các polypeptide sinh ra khi thủy phân ở dạ dày cịn cĩ các protein là những hợp chất phức tạp khơng hấp thu trong dạ dày, chúng đi xuống ruột và bị phân hủy tiếp ở. Để phân giải tiếp tục protein và polypeptide, trong ruột cĩ hai loại chất lỏng tiêu hĩa tham gia là dịch tuyến tụy và dịch ruột.
Dịch tuyến tụy cĩ thành phần hĩa học phức tạp và là chất lỏng kiềm yếu (pH 7,3-8,7) nhờ chứa bicarbonat natri (NaHCO3). Trong dịch tuyến tụy cĩ các enzym xúc tác thủy phân protein và các polypeptide là trypsin, chymotrypsin, carboxypolypeptidase.
Trypsin tiến hành thủy phân khơng triệt để, chỉ phân cắt 1/3 các liên kết peptide trong phân tử protein. Chymotrypsin cũng giống trypsin, xúc tác sự thủy phân protein và các polypeptide cao phân tử hình thành nên các peptide phân tử thấp, nĩ cắt các liên kết peptide mà trypsin khơng tác động đến. Cịn enzym carboxypolypeptidase phân giải polypeptide từ đầu carboxyl (đầu C) và aminopeptidase phân giải từ đầu cĩ amin (đầu N).
Tác động thủy phân của các protease tuyến tụy tạo ra một hỗn hợp các peptide ngắn, hầu hết là dipeptide và tripeptide, proteose, pepton và phần lớn các amino acid tự do.
Dịch ruột là một dịch lỏng, nhờn, hơi đục, kiềm nhẹ pH từ 7,8-8,3. Những enzym tiêu hĩa protein cĩ trong dịch ruột gồm cĩ: enterokinase, aminopeptidase, prolidase và di, tri-peptidase. Enterokinase là một enzym hoạt hĩa trypsin cĩ sự hiện diện của canci. Aminopeptidase phân giải polypeptide từ đầu cĩ nhĩm amin tự do và giải phĩng amino acid nhờ phân tách liên kết peptide gần kề với nhĩm amino
tự do, nhưng khơng thủy phân những liên kết của dipeptide hoặc amino acid cĩ đầu tận cùng Nitơ là proline. Prolidase là những enzym thủy phân liên kết liên quan đến proline. Cịn các dipeptidase phân giải dipeptide, tripeptidase phân giải tripeptide thành những amino acid tự do.
1.2.1.4 Đặc điểm một số protease thu nhận từ nguồn động vật [11]
Enzym là một chất xúc tác hữu hiệu nhất của cơ thể sống, về bản chất enzym cũng là các protein. Các enzym tiêu hĩa thường được tổng hợp dưới dạng bất hoạt, phù hợp để dự trữ hoặc vận chuyển từ vị trí tổng hợp đến vị trí hoạt động mong muốn như trường hợp của các protease: pepsin, trypsin, chymotrypsin, carboxypeptidase… Sự hoạt động của những enzym thủy phân này được hồn thành theo một trong hai con đường chủ yếu là sự tự hoạt hĩa như pepsin, trypsin… và nhĩm enzym thứ hai loại exopeptidase yêu cầu một hoặc vài ion kim loại chuyên biệt để hoạt hĩa tiền enzym.
1.2.1.4.1 Rennin [11]
Khái niệm
Rennin (E.C.3.4.4.3) là một protease acid tính, được tìm thấy ở dịch tiêu hĩa của ngăn thứ tư dạ dày bê, được khám phá bởi Heinz năm 1951.
Rennin là thành phần chủ yếu của rennet chiết rút từ ngăn thứ tư của dạ dày bê dưới 5 tháng tuổi. Enzym này do chính tế bào tuyến dạ dày tiết ra dùng để tiêu hĩa sữa cho những con vật mới sinh. Khi con vật lớn bắt đầu ăn thì sự tạo rennin được thay thế bằng pepsin.
Rennin đặc biệt cĩ khả năng đơng tụ sữa cao và phân giải protein chủ yếu là casein sữa, nên được gọi tên là “enzym đơng tụ sữa” điển hình.
Đặc điểm cấu tạo
Rennin cĩ trọng lượng phân tử khoảng 33000-34000 Da. Về mặt cấu tạo phân tử, các liên kết hydro cĩ thể đĩng vai trị quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt động.
Thành phần hĩa học: rennin chứa nhiều amino acid tính hơn nhưng tỷ lệ thấp hơn pepsin. Ngồi ra trong thành phần của rennin cịn chứa nhiều proline, serine và trong phân tử cĩ tới ba cầu nối disulfur.
Đặc tính và khả năng thủy phân của rennin
Rennin tinh khiết cĩ đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của rennin là pI=4,5. Rennin tinh khiết được bảo quản ở 150C. rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng khơng thấm qua màng tế bào ở mơi trường kiềm.
Đặc hiệu thủy phân: rennin là enzym thủy phân liên kết peptide trong protein và khơng làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amin. Rennin cĩ tác động mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi tyrosine và phenylalnine. Đặc tính thủy phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH, ở pH 6,8 rennin phân cắt trung bình 1/33, ở pH 2,3 phân cắt 1/8 số liên kết peptide trong phân tử casein (Bangjensen và cộng sự, 1964; Fish, 1980).
Sự hoạt hĩa prorennin thành rennin: prorennin là dạng tiền enzym của rennin cĩ trong màng nhầy dạ dày, ổn định ở pH 8. Rennin được tạo thành từ prorennin bởi tác động của acid, sự hoạt hĩa xảy ra mạnh ở pH 3 nhưng ở pH 5 thì sự hoạt hĩa xảy ra khơng đáng kể. Trong q trình hoạt hĩa 10-15% protein được tách ra dưới dạng peptide cĩ trọng lượng phân tử bằng 4000.
1.2.1.4.2 Pepsin [11,26,43,70]
Khái niệm
Pepsin (E.C.3.4.4.1) là enzym hàng đầu trong chuỗi enzym phân giải protein, là một enzym quan trọng của tuyến tiêu hĩa động vật, thuộc nhĩm enzym thủy phân.
Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật cĩ vú, chim, bị sát và cá. Ơû heo enzym tập trung ở những tế bào của phần đáy bao tử. Khi mới tiết ra enzym ở dạng tiền enzym khơng hoạt động gọi là pepsinogen, nhờ HCl pepsinogen được hoạt hĩa thành dạng hoạt động là pepsin.
Pepsin tham gia quá trình tiêu hĩa protein, phân hủy protein thành pepton, polypeptide mạch ngắn hơn. Tuy nhiên q trình tiêu hĩa của dạ dày chỉ là phân giải protein đến dạng trung gian, thủy phân protein chưa hồn tồn, sau đĩ các peptidase và protease khác trong tụy và ruột non thực hiện phân giải tiếp theo, chuyển thức ăn sang dạng hịa tan thích hợp với q trình tiêu hĩa triệt để hơn ở ruột non, tạo sản phẩm cuối là amino acid.
Đặc điểm cấu tạo
Phân tử pepsin là một sợi polypeptide đơn giản, hợp thành bởi 329 amino acid với đầu C là alanine và đầu N là isoleucine, cĩ thể cuộn lại làm thành hình cầu. Pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử S-S. Trong phân tử pepsin cĩ chứa S tạo thành ba cầu disulfua và một gốc acid phosphoric kết hợp với nhĩm hydroxyl của một trong các gốc serine.
Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhĩm carboxyl của acid glutamic, một nhân thơm của tyrosine.
Hình 1.4: Cấu tạo của pepsin heo [68]
Thành phần amino acid: pepsin chứa nhiều amino acid cĩ tính acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. Phân tử pepsin heo chứa khoảng 36 nhĩm carboxyl tự do, trong khi đĩ chỉ chứa hai gốc arginine, một gốc lysine, một gốc histidine. Pepsin cũng chứa nhiều amino acid kỵ nước (theo Perlmann, 1959). Số lượng amino acid cĩ mạch nhánh khơng phân cực là lớn làm cho enzym dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong hỗn hợp chứa nhiều dung mơi phân cực.
Trọng lượng phân tử của pepsin là 34500 Dalton. Pepsin được tạo thành từ màng nhầy, ở các phần khác nhau của dạ dày thì tạo các dạng pepsin khác nhau (Tayloz và cộng sự, 1958). Ngồi pepsin A (được tách trước tiên) cịn tách được pepsin B, C, D và các pepsinogen tương ứng.
Pepsin đđược tách từ nguồn động vật khác nhau (heo, bị) và các pepsin khác nhau của cùng một nguồn các enzym (A, B, C, D) thì cĩ đơi chút khác nhau về tính chất và thành phần hĩa học.
Tính chất [11]
Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vơ định hình, trắng hay vàng nhạt, mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi
chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì cĩ vị ngọt ( Dược điển Việt Nam).
Pepsin dễ hút Nm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, khơng tan trong cồn 950, ester, chloroform.
Điểm đẳng điện của pepsin gần pH 1. Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1-4, pH tối ưu của pepsin thay đổi tùy theo bản chất và trạng thái của cơ chất, thường hoạt động tối ưu ở pH 1,7-2,2.
Pepsin bền nhất ở pH khoảng từ 4-5 nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzym cĩ phần giảm đi, cịn ở pH q thấp thì dung dịch pepsin kém bền nhất, khi đĩ xảy ra hiện tượng tự tiêu của enzym, kèm theo sự tạo thành các phân tử nhỏ (Ceply và cộng sự, 1980). Từ pH 5,5 trở lên pepsin khơng hoạt động.
Sự hoạt hĩa pepsinogen thành pepsin: pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin là pepsinogen bất hoạt, khi tiếp xúc với mơi trường acid tự nhiên của bao tử (do HCl được tiết ra bởi các tế bào đỉnh vách của mơn vị heo tạo ra) hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hĩa thành pepsin. Quá trình hoạt hĩa pepsinogen là quá trình thủy phân liên kết peptide giữa acid glutamic 41 và isoleucine 42 giải phĩng peptide kìm hãm (ng và cộng sự, 1968). Pepsin được tạo thành lại tiếp tục xúc tác q trình giải phĩng peptide kìm hãm chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động. Vì vậy q trình này mang tính chất của một q trình tự xúc tác. Sự hoạt hĩa pepsinogen chỉ xảy ra trong mơi trường acid cĩ pH < 5,6.
Sự tự tiêu của pepsin: pepsin vừa cĩ bản chất là protein vừa là enzym phân giải protein vì vậy pepsin cĩ khả năng phân hủy chính nĩ. Theo Ingram, sự tự tiêu của pepsin xảy ra trong trường hợp pepsin ở dạng dung dịch, pH thấp (pH=4), nhiệt độ thích hợp (khoảng 450C) tạo ra nhiều thành phần cĩ phân tử lượng nhỏ hơn
pepsin, giảm 45% lượng tyrosine và chỉ thành phần nào cĩ đặc tính của pepsin gốc thì mới hoạt động.
Khả năng thủy phân protein của pepsin: pepsin tác động lên hầu hết các protein tự nhiên nhưng lại khơng cĩ khả năng phân cắt triệt đđể protein thức ăn thành các amino acid riêng lẻ mà chỉ cắt sơ bộ khoảng 10 - 15% nối liên kết peptide của protein tạo thành sản phNm pepton cĩ trọng lượng phân tử nhỏ để chuNn bị cho những qúa trình tiêu hĩa triệt để ở những giai đoạn tiếp theo trong ruột non. Pepsin phân cắt một cách dễ dàng các protein tan trong nước như albumin, hemoglobin, mystin, globulin, canxi…cịn những protein khơng tan hay các nucleoprotein, protein hình sợi như keratin, neucin, glagen, gluten, các nucleoprotein…pepsin phân cắt rất khĩ hay khơng cắt được.
Tính chất đặc hiệu: của pepsin phụ thuộc vào loại pepsin. Pepsin A và D tính đặc hiệu xảy ra trong phạm vi rộng hơn pepsin B và C. Pepsin A, D thủy phân lên cả hai cơ chất Hb và APD ( acetyl-L-phenylalanine-L-diiodtyrosine), cịn pepsin B chỉ cĩ hoạt động lên APD cịn pepsin C chỉ tác động lên cơ chất Hb.
Tính chất đặc hiệu của pepsin thể hiện ở chỗ là pepsin chỉ cắt những liên kết peptide tạo thành do amino acid thơm như tyrosine, phenylalanine, tryptophan liên kết với các amino acid khác. Pepsin chỉ thủy phân những liên kết peptide, khơng tác dụng vào những mối liên kết amid. Ngồi ra, pepsin cịn thủy phân liên kết giữa Ala-Ala, Ala-Ser, nĩ cũng cắt liên kết giữa Leu-Val, Val-Cis, Glu-Asn, Leu-Glu nhưng ở mức độ thấp hơn.
Cũng như nhiều protease khác, ngồi việc phân cắt được liên kết peptide, pepsin cĩ khả năng phân cắt cả liên kết ester (Losins và cộng sự, 1954) hay những hợp chất ester sulfite cĩ nhân thơm và cĩ thể làm đơng tụ sữa (Teply và cộng sự, 1980).
1.2.1.4.3 Pancreatin [11]
Thành phần enzym
Pancreatin là hệ enzym thủy phân xúc tác các phản ứng chuyển hĩa đạm, tinh bột, đường, acid nucleic, chất béo và một số chất khác ở trong ruột. Các enzym này gồm cĩ: trypsin, chymotrypsin, elastase, colagenase, amylase, lactase, saccharase, lipase, aminopeptidase, nuclease…Pancreatin cĩ trong tụy động vật máu nĩng và người ta thường trích ly pancreatin từ tụy tạng của heo.
Tính chất
Pancreatin cĩ hoạt tính mạnh nhất trong mơi trường kiềm và bị bất hoạt trong mơi trường acid mạnh, nĩ hoạt động mạnh nhất từ 2 đến 3 giờ sau khi ăn để thực hiện q trình tiêu hĩa ở ruột non. Pancreatin cĩ thể pepton hĩa nhiều loại thức ăn như sữa, thịt, cháo…và chuyển dầu, chất béo thành dạng nhũ tương dễ tiêu hĩa.
1.2.1.4.4 Trypsin [11,43]
Khái niệm
Trypsin (E.C.3.4.21.4) cĩ trong dịch tụy và dịch ruột non của người và động vật. Trong cơ thể sinh vật, trypsin hoạt động trong mơi trường kiềm ở ruột, do đĩ được gọi là protease kiềm tính. Vai trị của trypsin là tiếp tục thủy phân các protein thức ăn cịn lại sau khi đã bị thủy phân một phần ở dạ dày tạo chủ yếu là dipeptide và các amino acid.
Đặc điểm cấu tạo
Trypsin là một chuỗi polypeptide cĩ 223 amino acid, trọng lượng phân tử 22680-23400Da. pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp của trypsin là 7,8-9,5. Tuy nhiên hoạt tính của dung dịch trypsin vẫn cĩ thể ổn định ở pH 3-5. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của trypsin là nhiệt độ cơ thể nhưng nĩ vẫn
trypsin cĩ khả năng thủy phân mạnh các loại cơ chất như casein, hemoglobin hay gelatin. Khi đun nĩng dung dịch lên đến 900C và pH trong khoảng 6-8 thì dung dịch enzym bị mất hoạt tính hồn tồn.
Trong mơi trường pH 8 và cĩ sự hiện diện của Ca thì enzym từ dạng khơng