1.2.2.3.3 Keratin [23,53,59]
Keratin là protein cấu trúc của các tế bào biểu mơ ở các lớp ngồi cùng của da, được phân tách từ tĩc, mĩng vuốt, và lơng vũ. Keratin hồn tồn khơng tan trong nước lạnh hoặc nĩng, khơng bị tấn cơng bởi các enzym thủy phân, vì vậy khơng thể thay thế protein trong khẩu phần ăn. Độ bền của keratin cĩ được là do cĩ nhiều liên kết disulfide của cystine. Thành phần amino acid của keratin khác với của collagen. Cystine cĩ thể chiếm khoảng 24% amino acid tổng số. Các chuỗi peptide của keratin được sắp xếp song song và khơng song song với số lượng bằng nhau được gấp nếp thành các phiến, trong đĩ các chuỗi peptide được nối với nhau bằng liên kết hydro giữa các nhĩm carbonyl (C=O) và imino (NH). Chiều dài của các sợi keratin phụ thuộc vào hàm lượng nước của chúng. Chúng cĩ thể liên kết gần 16 % nước, sự hydrat hĩa này giúp gia tăng chiều dài các sợi lên tới 10-12%.
Keratin thuộc nhĩm protein cĩ cấu trúc hình sợi, là thành phần chính của tĩc, vảy bị sát, lơng chim, mĩng, sừng… Keratin được đặc trưng bởi tính tan hồn tồn trong nước, trong các dung dịch muối trung tính, trong kiềm, trong acid và trong các
dung mơi hữu cơ. Đem keratin thủy phân trong một thời gian dài với các acid vơ cơ thì keratin bị thủy phân thành khoảng 7-14 acid amin. Những protein này chứa tỷ lệ amino acid chứa lưu huỳnh cao, phần lớn là cysteine, hình thành những cầu nối di- sulfide giữa những phân tử riêng lẻ tạo thành cấu trúc khá cứng. Tĩc người cĩ gần 14% cysteine.
Cĩ nhiều loại keratin khác nhau: α-keratin trong tĩc, mĩng, sừng, mĩng vuốt của động vật cĩ vú; β-keratin cứng hơn cĩ ở vảy và vuốt của lồi giáp sát, lơng, mỏ và vuốt của chim.
1.2.2.3.4 Elastin [38,48]
Là protein của mơ liên kết, cĩ trong sợi đàn hồi. Elastin khơng hịa tan trong nước, khơng cĩ khả năng trương phồng. Về tính chất thì elastin là protein hình sợi bền hơn collagen.
Elastin chủ yếu gồm cĩ các amino acid như glycine, valine, alanine và proline, 1/3 các amino acid trong elastin là glycine. Glycine phân bố ngẫu nhiên trên suốt phân tử elastin, sự phân bố ngẫu nhiên này tạo cho elastin cĩ tính kỵ nước cao vì vậy chúng cĩ thể trượt trên những phân tử khác, hoặc kéo giãn để duy trì tính tồn vẹn của cấu trúc và tạo sự đàn hồi.
Elastin là một protein đặc biệt với trọng lượng phân tử từ 64-66 kDa, và hình dạng cuộn xoắn khơng theo quy luật hoặc ngẫu nhiên tạo thành bởi 830 amino acid.
1.2.2.4 Phương pháp thu nhận protein từ phế liệu động vật [1,2,18,21]
Thu nhận protein thường cĩ hai cách, thứ nhất protein được chiết tách từ trong dung dịch bằng dung mơi; thứ hai, protein ở tướng rắn, người ta thường loại
tạp chất kèm theo bằng các phương pháp thích hợp, cách này thường áp dụng cho các protein khơng tan (như fibroin của tơ, keratin của tĩc…)
Để thu nhận protein cĩ hiệu quả cần phải nghiền thật nhỏ các mơ bằng cối nghiền hoặc máy xay đồng hĩa (để phá vỡ tế bào). Protein sau khi nghiền thật kỹ được chiết xuất bằng các dung dịch muối cĩ nồng độ khác nhau khoảng 8-10%. Các muối khác nhau cĩ tác dụng hịa tan protein khác nhau. Một số anion và cation được xếp theo thứ tự giảm dần về tác dụng hịa tan protein: Li+ > K+ > Na+ > P2O44-
> PO43- > CNS- > HCO3- > I- > Cl-. pH mơi trường cũng cĩ tác dụng mạnh đến sự hịa tan protein nên đa số các muối được sử dụng ở dạng dung dịch đệm như phosphate, đệm borate, citrate…
Việc chiết xuất protein bằng hỗn hợp alcol-muối cũng đã cho những kết quả rất tốt. Điều này cho phép chiết xuất các protein riêng rẽ ở những nồng độ alcol khác nhau. Người ta cũng thường dùng glycerine để chiết xuất protein ở dạng nguyên thể khơng bị biến chất.
Để thu nhận chế phẩm protein từ các nguồn nguyên liệu khác nhau quan trọng nhất là lựa chọn phương pháp thích hợp. Mỗi phương pháp đều cĩ ưu nhược điểm cũng như những mặt hạn chế nhất định mà dựa vào đĩ để quyết định thực hiện phương pháp nào.
Những nguyên liệu dùng để thu protein sau khi được thu nhận sẽ được xử lý sơ bộ để loại thức ăn thừa, tiếp đĩ xay nhỏ và sau đĩ sử dụng các phương pháp khác nhau để tách chiết protein tùy theo tính chất của protein cần tách chiết như:
1.2.2.4.1 Dùng pI
Giá trị pH mà tại đĩ phân tử protein trung hịa điện gọi là điểm đẳng điện của protein (pI), ở giá trị pH = pI thì protein khơng tích điện sẽ khơng chuyển dịch trong điện trường, phân tử protein kém bền nhất cĩ thể gắn kết với nhau và kết tủa.
1.2.2.4.2 Dùng dung mơi hữu cơ (aceton, etanol)
Độ hịa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong các yếu tố đĩ là hằng số điện mơi của dung dịch. Những phân tử dung mơi cĩ hằng số điện mơi lớn (nước, dimethylsulphoxid) cĩ thể ổn định các tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hịa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung mơi cĩ hằng số điện mơi nhỏ (aceton, etanol) cĩ tác dụng khử nước của phân tử protein làm phá hủy màng nước, ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong mơi trường dẫn đến sự kết tủa protein. Quá trình này phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp để tránh protein bị biến tính.
1.2.2.4.3 Dùng muối
Thường dùng muối NaCl, (NH4)2SO4 để tủa protein dựa trên nguyên tắc là ở nồng độ cao, muối vừa làm trung hịa điện vừa tranh giành vỏ nước của protein nên các protein mất vỏ nước, liên kết với nhau và kết tủa xuống.
Ơû nồng độ muối thấp, đa phần protein cĩ độ hịa tan lớn nên chỉ cĩ một số tạp chất kết tủa. Khi tăng dần nồng độ muối thì sẽ cĩ hiện tượng tranh giành vỏ nước của protein làm cho các protein kết tủa. Ơû nồng độ muối bão hịa thì tồn bộ protein tủa hết thu được hỗn hợp protein, do đĩ dộ tinh sạch khơng cao. Để tách riêng các protein ta sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn, với các nồng độ muối khác nhau sẽ cho các phân đoạn protein khác nhau.
1.2.2.4.4 Gia nhiệt gây tủa protein
Hầu hết protein khơng ổn định dưới tác dụng của nhiệt, ở nhiệt độ cao các liên kết trong cấu trúc phân tử protein bị đứt, các cấu trúc bậc 2, bậc 3 và bậc 4 bị giãn mạch, xuất hiện các nhĩm kỵ nước trên bề mặt phân tử protein, làm giảm tương tác giữa protein và nước nên gây kết tủa. Tất cả các trường hợp biến tính do
như bị phá hủy hồn tồn. Mỗi loại protein khác nhau sẽ cĩ nhiệt độ biến tính khác nhau, cường độ và thời gian xử lý nhiệt sẽ quyết định mức độ các biến đổi, trong đa số các trường hợp các protein bắt đầu bị biến tính ở nhiệt độ khoảng 45-500C, nhiệt độ càng tăng sự biến tính càng mạnh mẽ.
1.2.2.4.5 Kết tủa bằng PEG (polyetylenglycol): PEG làm giảm hằng số điện
mơi do đĩ làm giảm độ hịa tan của protein và làm protein kết tủa. Thường dùng PEG cĩ nồng độ từ 20-30% để kết tủa protein, nồng độ cao hơn sẽ cĩ độ nhớt quá cao khĩ lọc hay ly tâm.
1.2.2.4.6 Sử dụng Tannin (trong trà, vỏ trái cây xanh) là những chất cĩ bản
chất là polyphenol, phenol cĩ khả năng kết tủa, khi gặp protein, Tannin sẽ làm protein kết tủa.
1.2.2.5 Ứng dụng của các protein thu được 1.2.2.5.1 Ưùng dụng trong thực phẩm [49]
Máu động vật cĩ lượng protein cao với sự cân bằng tốt các amino acid và lượng ion heme cao, và là một sản phẩm phụ quan trọng cĩ thể ăn được. Ơû châu Aâu, máu động vật được sử dụng làm xúc xích huyết, bánh pudding huyết, biscuist và bánh mì. Ơû châu Á, máu được sử dụng làm khối đơng huyết, bánh huyết và bánh pudding huyết. Nĩ cũng được sử dụng trong lĩnh vực như khơng phải cơng nghệ thực phẩm như làm phân bĩn, feedsruff và chất kết dính.
Máu được sử dụng trong thực phẩm như là một chất nhũ hĩa, chất ổn định, bổ sung màu và là thành phần dinh dưỡng. Hầu hết máu được sử dụng làm thức ăn chăn nuơi ở dạng bột huyết. Được sử dụng như nguồn bổ sung protein, thay thế sữa, bổ sung lysine hoặc ổn định vitamin và là một nguồn giàu khống vi lượng. Plasma cĩ khả năng tạo gel bởi vì cĩ chứa tới 60% albumin.
Máu cũng được ứng dụng trong cơng nghiệp như một chất kết dính và trong sản xuất giấy, gỗ dán, sợi, plastic và keo. Được sử dụng dưới dạng thuốc xịt như thuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm.
Gelatin được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, sử dụng chính trong sản xuất các mĩn tráng miệng thạch vì tính chất “tan trong miệng” của nĩ. Gelatin cũng được sử dụng rộng rãi như là chất ổn định cho kem và các mĩn tráng miệng đơng lạnh khác. Gelatin cĩ độ bloom cao được thêm vào như chất keo bảo vệ kem, yoghurt và bánh kem vì gelatin được cho là cĩ khả năng ức chế hình thành các tinh thể đá và sự kết tinh lại của lactose khi bảo quản.
1.2.2.5.2 Ưùng dụng trong y dược [49]
Xấp xỉ gần 6,5% tổng sản phẩm của gelatin được ứng dụng trong y dược. Hầu hết được sử dụng làm màng bao thuốc, tác nhân liên kết trong sản xuất thuốc viên. Là thành phần quan trọng trong thuốc mỡ bảo vệ như zinc gelatin dùng điều trị loét tĩnh mạch.
Gelatin cĩ thể được làm thành gạc vơ trùng dùng trong phẫu thuật. Vì gelatin là protein nên cũng được sử dụng như chất làm giãn nở plasma cho máu trong trường hợp bị sốc và bị thương nặng.
Những thành phần được phân tách từ máu cĩ nhiều tính chất chữa bệnh. Plasma chiếm phần lớn (63%), gồm cĩ albumin (3,5%), globulin và fibrinogen (4%). Trong nghiên cứu, nhiều sản phẩm máu được sử dụng như mơi trường dinh dưỡng để nuơi cấy mơ, pepton cho vi sinh vật sử dụng. Glycerolphosphate, albumin, globulin, sphingomyelin và catalase cũng được sử dụng trong phân tích sinh học. Nhiều thành phần của máu như fibrinogen, fibrinolysin, serotonin, kalikreninsa, immunoglobulin và plasminogen được phân tách để ứng dụng cho hĩa học và y học.
Chiết xuất fibrin từ huyết heo được sử dụng như nguồn các acid amin , chúng kết hợp với nhau trong dung dịch để nuơi bệnh nhân sau phẫu thuật.
Albumin bị tinh sạch được sử dụng để kiểm tra yếu tố Rh ở con người và là chất ổn định vaccine. Nĩ cũng được sử dụng để kiểm tra độ nhạy kháng sinh.
1.2.3 THU NHẬN AMINO ACID TỪ PHẾ LIỆU GIÀU ĐẠM CỦA ĐỘNG
VẬT
1.2.3.1 Khái niệm
Amino acid là sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân protein, peptid, đồng thời là đơn vị cấu tạo, là những viên gạch xây dựng nên các phân tử peptid và protein, tham gia vào q trình chuyển hĩa và tổng hợp giúp cơ thể xây dựng nên tế bào và mơ. Cĩ 20 loại amino acid Aspartic acid, Threonine, Serine, Glutamic acid, Proline, Glycine, Alanine, Valine, Methionine, Isoleucine Leucine, Phenyl alanine, Histidine Lysine, Tyrosine, Arginine, Tryptophan, Cystine…. Các amino acid thiết yếu cho cơ thể phải được cung cấp từ nguồn bên ngồi mới đáp ứng đủ nhu cầu hằng ngày của cơ thể như isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine và lysine.
Ngồi vai trị cấu tạo, amino acid cịn cĩ chức năng quan trọng khác, ví dụ glycin và acid glutamic cĩ vai trị trong q trình dẫn truyền thần kinh.
1.2.3.2 Nguồn thu amino acid [47]
Khi đun nĩng protein trong dung dịch acid hoặc base, hoặc nhờ tác dụng của các enzym protease, các liên kết peptid bị đứt và protein bị phân cắt thành các chuỗi polypeptid và cuối cùng thành các amino acid. Nguồn protein được sử dụng để thu nhận amino acid là ngồi những protein truyền thống ta cịn cĩ thể thu nhận amino acid từ những phế liệu giàu đạm như phế liệu lị mổ động vật: dạ dày, tụy, ruột, phổi, lơng, mĩng, sừng…; phế liệu từ thủy sản: phế liệu tơm, cá, mực, da cá,
sụn, mắt cá… Hầu hết các amino acid thu nhận được khi thủy phân protein bằng acid hay enzym đều ở dạng L-amino acid, cịn nếu thủy phân bằng kiềm thì amino acid dạng D trội hơn dạng L.
1.2.3.3 Đặc điểm các amino acid từ phế liệu động vật [20,31,49,64]
Amino acid là cấu tử thành phần tạo nên phân tử protein, cĩ khoảng 20 amino acid tham gia trong cấu tạo protein. Amino acid là chất mà cơ thể cĩ thể hấp thu một cách dễ dàng và trực tiếp. Cơ thể cũng cĩ thể tổng hợp được các amino acid nhưng riêng các amino acid khơng thay thế thì cơ thể khơng tổng hợp được hoặc cĩ vài amino acid tổng hợp được nhưng lượng rất nhỏ khơng đủ cho cơ thể. Thiếu một số hay một amino acid nào đĩ cĩ thể dẫn đến bệnh tật cho cơ thể hay suy giảm tình trạng sức khỏe bình thường của con người. Do đĩ, con người phải sử dụng amino acid từ nguồn thức ăn giàu protein cĩ nguồn gốc từ động thực vật, protein động vật cĩ đầy đủ lượng amino acid khơng thay thế hơn protein thực vật, do vậy về giá trị dinh dưỡng protein động vật cao hơn protein thực vật. Ngồi nguồn protide từ động vật ta cũng cĩ thể tận dụng các phụ phế liệu của lị mổ động vật, nhà máy chế biến thủy sản… để thu nhận amino acid giảm giá thành sản phẩm.
Tùy theo nguồn protein khác nhau mà ta cĩ thành phần amino acid khác nhau. Ví dụ 1: thành phần amino acid trong collagen của da cá trê hịa tan trong acid và pepsin thể hiện trong bảng 1.1:
Bảng 1.1: Thành phần amino acid của collagen tan trong acid và được hịa tan bởi pepsin từ da cá trê [31]
ASC (acid-soluble collagens): collagen tan trong acid.
PSC (pepsin-solubilized collagens): collagen được hịa tan bởi pepsin. Từ bảng 1.1 nhận thấy: glycine là amino acid nhiều nhất trong collagen, chiếm 23%; half-cystine ít được tìm thấy trong collagen; methionine, histidine và tyrosine chiếm tỷ lệ thấp, lượng imino acid tổng số chiếm khoảng 17%.
Ví dụ 2: thành phần amino acid của Fibroin tơ và Keratin từ sợi len được xác định sau khi thủy phân bằng acid HCl 6N ở 1050C khoảng 24 giờ, được thể hiện ở bảng 1.2.
Bảng 1.2: Thành phần amino acid của Fibroin tơ và Keratin [37]
1.2.3.4 Phương pháp thu nhận hỗn hợp amino acid từ phế liệu động vật [12, 16,19,20,27]
Cĩ hai phương pháp sử dụng để thu nhận hỗn hợp amino acid là phương pháp hĩa học (sử dụng acid, base) và phương pháp sinh học (sử dụng enzym).
Phương pháp hĩa học thường dùng cho các protid động vật khĩ phân giải (lơng, mĩng, sừng, gân…). Ngược lại đối với các phế liệu thực vật ta thường dùng phương pháp thủy phân bằng enzym.
1.2.3.4.1 Phương pháp hĩa học
Thủy phân bằng acid
- Dùng acid HCl 6N, H2SO46N… để thủy phân ở nhiệt độ 100-1200C trong 10- 24 giờ được các amino acid tự do. Nhưng trong kỹ thuật này tryptophan bị phá hủy hồn tồn, serine và threonine bị phá hủy một phần, glutamine và asparagine phân ly thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+, methionine cĩ thể bị oxy hĩa.
Thủy phân bằng kiềm
- Nguyên liệu được loại mỡ, tạp chất và rửa sạch.
- Nếu thủy phân bằng kiềm nĩng thì cysteine, serine và threonine bị phá hủy, nhưng tryptophane khơng bị phá hủy, các amino acid đều bị racemic hĩa tạo dạng D-amino acid nhiều hơn dạng L-amino acid. Do đĩ phương pháp này dùng để xác định tryptophan.
1.2.3.4.2 Phương pháp sinh học
- Nguyên liệu được loại mỡ, tạp chất và rửa sạch.
- Bổ sung nước với tỷ lệ nguyên liệu/ dung dịch đệm là 1/ 2,5
- Bổ sung enzym (endopeptidase hoặc exopeptidase) với nồng độ, pH, thời gian thủy phân thích hợp.
- Vơ hoạt tác động của enzym. - Tinh chế, thu hồi sản phẩm.
1.2.3.5 So sánh ưu nhược điểm hai phương pháp [20] 1.2.3.5.1 Ưu nhược điểm phương pháp hĩa học
Ưu điểm là thời gian và quy trình sản xuất được rút ngắn hơn. Hiệu suất thủy phân cao nên sản phẩm giàu amino acid, hương vị thơm ngon.
Nhược điểm là tính chất độc hại với cơng nhân sản xuất do sử dụng acid mạnh, kiềm mạnh. Nhiệt độ cao, áp suất cao…Bị phá hủy một số amino acid trong quá trình thủy phân như lysine, arginine, cysteine, tryptophane…
1.2.3.5.2 Ưu nhược điểm phương pháp sinh học
Ưu điểm là thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, khơng quá đắt tiền, phù hợp với điều kiện sản xuất ở địa phương, vốn đầu tư ban đầu thấp. Khơng cần sử dụng thiết